항암제에 내성을 보이는 대장암 세포에서 S100A14의 기능에 대한 연구

학위논문 (석사) -- 서울대학교 대학원 : 융합과학기술대학원 분자의학 및 바이오제약학과, 2021. 2. 이호영.Colon cancer is the third most common cancer. Of the several therapies for colon cancer, chemotherapy has been used most frequently. 5-Flourouracil (5-Fu) and oxaliplatin are first-line chemotherapeutic agents used for treatment of colon cancer. Although these drugs are commonly used for therapy, several evidences have indicated that anti-cancer drugs induce chemoresistance, therefore reducing the effectiveness of treatment. Because of heterogeneity, cancer cells respond to treatments differently. Remarkably, the stem cell property of cancer cells has been reported to be highly correlated with chemoresistance. In this paper, when cancer cells become resistant to anticancer drugs, we investigate the changes in cell properties and internal cell signaling pathways Here, we generated drug resistant colon cancer cells after chronic exposure to 5-Fu and oxaliplatin. We found that resistant cells have highly upregulated stemness property. Through microarray and big data analysis, we found that S100A14 level was most decreased in drug resistant cells. Increased stemness property in resistant cells was reduced after S100A14 transfection. We also found that S100A14 level was decreased in colon cancer with high stem cell population. To investigate how S100A14 regulates stemness, we analyzed resistant cells using luciferase assay to find increased signaling pathway. STAT3 pathway was most upregulated in both cells. HCT116 resistant cells have reduced S100A14 expression and increased STAT3 expression. To determine the relation between S100A14 and STAT3, we analyzed STAT3 level in S100A14 modulated cells. STAT3 protein level was downregulated in S100A14 overexpression cells, while it was increased in S100A14 knockdown cells. Next, we investigated that S100A14 regulated STAT3 at a mRNA level or protein level. There are no significant changes in mRNA levels between parental cell and resistant cells. On the other hand, STAT3 proteins were rapidly degraded when S100A14 level was high; therefore, we have demonstrated S100A14 regulates STAT3 stability. Finally, we found that STAT3 stability was regulated by interaction with S100A14. Through immunoprecipitation, we confirmed that STAT3 degradation was increased because S100A14 facilitated binding of more ubiquitin to STAT3. These findings suggest novel function of S100A14 in regulation of stemness property in chemoresistant colon cancer. Moreover, S100A14 level can be used to estimate stem cell population in colon cancer. Thus, S100A14 can be a potential biomarker for chemotherapy of colon cancer대장암은 전 세계적으로 세 번째로 흔한 암종으로 주요 사망 원인 중 하나이다. 대장암 치료에 사용되는 다양한 방법 중에서, 항암제를 이용하는 화학요법은 가장 많이 사용되어 진다. 5-플로오로 우라실 (5-Fluorouracil)과 옥살리플라틴 (oxaliplatin)은 대장암 치료에 있어 주로 사용되는 화학요법제이다. 이와 같은 약물은 치료에 있어 흔히 사용되지만, 다양한 연구들은 항암제가 오히려 약에 대한 저항성을 유도해 치료 효율을 낮춘다는 것을 보여주고 있다. 암세포 내부의 이질성 (heterogeneity)으로 인해, 암세포는 치료에 있어 다양한 반응성을 가지게 된다. 특히 암 줄기세포는 항암제 저항성과 높은 상관관계를 가진다는 것으로 보고되고 있다. 본 논문에서는 암세포가 항암제 저항성을 가지게 되었을 때, 세포의 성질 변화와 그리고 이를 유도하는 내부 기작을 밝히고자 하였다. 우선 대장암 치료에 많이 쓰이는 항암제인 5-플로오로우라실 (5-Fluorouracil)과 옥살리플라틴 (oxaliplatin)을 세포에 장기간 노출시켜 약물에 저항성을 가지는 세포를 구축하였다. 이렇게 만들어진 항암제 내성 세포는 증가된 줄기세포능 (Stemness)을 가진다는 것을 발견하였다. 그리고 구축된 세포 간의 마이크로어레이 실험을 통해 저항성을 가진 세포에서 변화하는 유전자를 분석하였고, 이를 통해 S100A14가 저항성 세포에서 가장 낮아져 있다는 것을 발견하였다. 저항성 세포에서 증가되어진 줄기세포능은 S100A14가 transfection될 경우 낮아졌으며, 대장암에서 줄기세포능을 많이 가지는 부분일수록 낮은 S100A14 발현을 보인다는 것을 확인하였다. S100A14가 어떻게 줄기세포능을 조절하는지 알아보기 위해서, 본 실험에서는 luciferase assay를 실행하여 항암제 저항성 세포에서 증가되어진 기작을 찾고자 하였다. 다양한 신호전달 경로 중에서 STAT3와 관련된 신호전달 기작이 대장암 항암제 저항성 세포에서 큰 폭으로 증가 되어있는 것을 확인하였다. 화학 항암제에 저항성을 가진 HCT116 세포는 낮은 S100A14 발현 보이며, 저항성이 없는 기존의 HCT116 세포에 비해 높은 수준의 STAT3를 가진다. S100A14와 STAT3 사이의 관계를 알아보기 위해, S100A14를 없애거나, 과발현시켜 양을 조절하였을 경우 STAT3가 달라지는지를 확인해 보았다. 저항성 세포에서 STAT3 단백질은 S100A14를 transfection할 경우 줄어들었으며, 반대로 S100A14를 없앤 세포에서는 STAT3 단백질이 증가하였다. 우리는 이러한 과정에서 S100A14가 STAT3를 mRNA 발현이 아닌 단백질 수준에서 조절한다는 것을 찾아냈고, S100A14가 STAT3 분해를 조절한다는 것을 알아냈다. S100A14가 어떻게 STAT3 분해를 조절하는지 알아보기 위해 면역침강실험을 진행하였고, 이를 통해 S100A14가 STAT3에 결합하여 STAT3의 유비퀴틴화 (ubiquitination)를 조절하여 STAT3 분해를 유도한다는 것을 밝혔다. 이 연구를 통해, 화학 항암제에 저항성을 보이는 대장암 세포에서 줄기세포능 조절에 있어서 S100A14의 새로운 기능을 규명하였다. S100A14은 STAT3의 분해를 조절하는데, 저항성 세포에서는 S100A14의 발현이 낮아져 STAT3가 증가하게 되고, 이로 인해 줄기세포능을 유도하는 여러 요소들이 증가하게 된다는 것을 본 논문을 통해 밝힌 것이다. 더 나아가, S100A14가 항암제 치료의 효과를 예측할 수 있는 바이오 마커로 사용될 수 있다는 점을 본 논문을 통해 제시하였다.ABSTRACT . 1 CONTENS 4 LIST OF FIGURES 6 INTRODUCTION . 7 METERIALS AND METHODS 10 1. Cell lines, and Cultures . 10 2. MTT assay. 10 3. Anchorage independent and dependent assay . 10 4. Western blot and immunoprecipitation assay 11 5. Real-time PCR 12 6. Sphere formation assay 12 7. In vivo serial dilution . 12 8. Flow cytometric cell Sorting 12 9. Immunofluorescence 13 10. Luciferase assay 13 RESULTS . 14 1. Generation of 5-Flourouracil/ Oxaliplatin resistant cells . 14 2. Resistant colon cancer cells increase stemness phenotype compared with parental cell . 14 3. S100A14 expression was lowered after drug treatment in colon cancer cells . 15 4. S100A14 level in cells affects stemness properties . 16 5. Stemness population in colon cancer expressed S100A14 at decreased levels 24 6. S100A14 downregulates STAT3 and stemness axis 24 7. S100A14 regulates STAT3 stability through increasing ubiquitination . 32 DISCUSSION 36 REFERENCES . 39 국문초록 . 42 ACKNOWLEDGEMENT 44Maste

An Analysis on the Effects of Wee Class - Focusing on middle schools in Seoul -

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 교육학과, 2017. 2. 정동욱.본 연구는 학생의 정서 밎 인지 발달에 대한 Wee 클래스 효과 분석하고, 그 효과 차이를 유발하는 학교 및 교사 특성 요인을 분석하는데 목적을 둔다. Wee 클래스는 위기학생 지원을 위해 2008년 도입된 학교안전통합시스템(Wee 프로젝트)의 하나로, 단위학교에서의 학교 부적응 예방 및 상담 지원 프로그램을 의미한다. Wee 클래스 평가와 질 제고에 대한 학문적 논의는 미비한 편이다. 대부분의 선행연구는 데이터 및 분석방법 상 선택편의(Selection Bias) 문제로 인해 일반화의 한계를 가지며, 교육복지서비스의 통합적 성격에 대한 고려가 부족하다. 이에 본 연구는 개입이론(Intervention Theory)의 생태학적 위기개입모형(Ecological model)과 학교상담 이론의 종합적 학교상담모형을 이론적 근거로 Wee 클래스 효과를 실증적으로 분석하였다. 본 연구에서 설정한 연구 문제는 다음과 같다. 첫째, 학생의 정서 및 인지 발달에 대한 Wee 클래스 효과는 어떠한가? 둘째, Wee 클래스 효과 차이를 유발하는 요인은 무엇인가? 이를 위해 본 연구는 서울교육종단연구(Seoul Educational Longitudinal Study, 이하 SELS) 4～6차년도(2013～2015년) 초4 코호트의 중학교 데이터를 활용하였다. 분석방법으로는 선택편의 최소화를 위해 경향점수매칭(Propensity Score Matching, 이하 PSM)을 활용하여 비교집단 간 동질성을 확보한 뒤, 중다회귀분석(OLS) 및 포아송(Poisson) 회귀분석을 실시하였다. 첫 번째 연구문제의 정서 및 인지 발달은 정서 지수, 학교폭력 피해경험 빈도, 국어․수학 학업성취도를 종속변수로 하여 분석하였으며, 학교폭력 피해경험 빈도는 가산자료(Count data)이므로 선형회귀(OLS)와 포아송 회귀분석 결과를 비교하여 함께 제시하였다. 두 번째 연구문제의 차별적 효과 분석을 위해서는 상호작용항을 활용하여 학교 및 교사 특성에 따른 Wee 클래스 효과 차이를 살펴보았다. 또한 누적 실시 기간에 따른 효과 차이를 확인하기 위해 Wee 클래스 1년 시행 집단, 2년 시행 집단을 각각 미시행 집단과 매칭한 후 분석하였다. 주요 연구결과는 다음과 같다. 첫째, PSM 활용 분석 결과, 정서 지수, 학교폭력 피해경험 빈도, 학업성취도에 대해 Wee 클래스 2년 시행의 유의미한 정적 효과가 나타났다. 1년 시행의 경우 정적 효과를 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다. 그러나 PSM 미활용 분석에서는, Wee 클래스 2년 시행의 정서 지수, 성적 향상에 대한 정적 효과가 사라졌다. 경향점수매칭을 하지 않은 Wee 클래스 1년 시행에 대한 분석에서는, 통계적으로 유의하지 않았으나 정서 지수, 성적에 대한 부적 효과가 보고되었다. 이는 PSM을 통해 정책 효과에 영향을 미칠 수 있는 다른 혼동요인들이 적절히 통제되어 보다 엄밀한 분석 결과가 도출된 것이라고 볼 수 있다. 둘째, 학교특성 중 개방적 학교풍토, 방과후 동아리수, 교사특성 중 교사-학생 대면정도, 정규직 교직원 비율, 전문상담교사 배치 의 차별적 효과가 나타났다. 개방적 학교풍토 조성도가 높을수록, 방과후 동아리가 활성화되어 있을수록 성적 향상도가 컸으며, 이는 생태학적 위기개입모형의 이론적 설명과 일치한다. 교사-학생 대면정도가 높을 때 학교폭력 피해경험이 더 크게 감소했고, 수학 성적 향상도가 높았다. 높은 정규직 교직원 비율은 정서 발달에 긍정적 영향을 미쳤으며, 전문상담교사 배치는 수학 성적에 정적인 차별적 효과를 나타냈다. 이는 종합적상담모형에서의 프로그램 요소 및 시간 배분, 자원과 관련한 이론적 근거와 일치한다. 본 연구의 의의 및 정책적 시사점을 제시하면 다음과 같다. 첫째, Wee 클래스가 취약계층 학생들에게서 더 뚜렷한 효과를 보인다는 점에서 매우 긍정적임을 밝혔다. 향후 Wee 클래스 및 관련 교육복지사업 확대 논의에 있어, 위기학생 비율이 높은 곳에 Wee 클래스를 우선적으로 확대 실시하는 방안이 고려될 필요가 있다. 둘째, Wee 클래스 운영 연차가 늘어남에 따라 정적 효과가 증대됨을 실증적으로 밝혔으며, Wee 클래스에 대한 보다 중·장기적 관점의 평가와 질 제고가 필요함을 제언하였다. 셋째, Wee 클래스 효과 증대를 위해 학교 내·외 구성원 간 협력을 증진시킬 수 있는 개방적 학교풍토 조성이 필요하며, 위기학생을 위한 방과후 동아리 활성화 노력이 필요하다. 또한 종합적상담모형을 통해서도 지지되듯, 교사가 학생과의 직접적인 상호작용 및 교수학습에 충분한 시간을 할애할 수 있도록 하는 여건 조성이 요구된다. 전문상담인력 확보 및 질 관리는 Wee 클래스의 성공적 운영에 핵심 요소이므로, 이와 관련한 구체적인 데이터 확보 및 후속 연구도 제안하였다. 넷째, 정책 효과 분석에 있어 PSM 활용 분석법의 높은 내적 타당도를 확인하였고, 교육복지 관련 중복 사업 변인 및 혼란변인 통제의 중요성을 보여주었다. 교육복지사업의 양적 팽창을 넘어 질 관리 및 통합적 연계망 구축이 요구됨을 감안할 때, 향후 교육복지사업 평가에 있어서도 이러한 교육복지서비스 특성이 고려되어야 함을 제언하는 바이다.Ⅰ. 서 론 1 1. 연구의 필요성 및 목적 1 2. 연구 문제 4 3. 연구의 의의 5 4. 연구의 한계 6 Ⅱ. 이론적 배경 7 1. 개입이론(Intervention Theory) 7 가. 위기 개입 7 나. 생태학적 위기개입모형(Ecological model) 10 2. 학교상담 12 가. 학교상담 12 나. 종합적인 학교상담모형 14 3. Wee 프로젝트(학교안전통합시스템) 17 가. Wee 프로젝트 17 나. Wee 클래스 19 4. 선행연구 분석 20 Ⅲ. 연구 방법 23 1. 분석틀 23 2. 분석 자료 24 3. 변수 구성 25 가. 위기 학생 정의 25 나. 주요 변수 및 설명 26 4. 분석 방법 및 모형 29 가. 경향점수매칭(Propensity Score Matching) 29 나. 다중선형 회귀분석(Multiple Linear Regression) 32 다. 포아송 회귀분석(Poisson Regression) 33 Ⅳ. 분석 결과 35 1. 기술통계 분석 35 2. Wee 클래스의 효과 분석 37 가. Wee 클래스가 정서 발달에 미치는 영향 39 나. Wee 클래스가 학교폭력 피해경험 빈도에 미치는 영향 41 다. Wee 클래스가 학업성취도에 미치는 영향 44 2. Wee 클래스의 차별적 효과 분석 46 가. 학교특성별 Wee 클래스의 차별적 효과 46 나. 교사특성별 Wee 클래스의 차별적 효과 49 Ⅴ. 논의 52 1. 교육복지사업으로서의 Wee 클래스와 네트워크 52 2. 학교 및 교사 특성에 따른 차별적 효과 55 3. Wee 클래스 효과의 장기성 57 4. 경향점수매칭 활용 분석 57 Ⅵ. 결론 59 참고문헌 63 부 록 72 Abstract 79Maste

Angiogenesis and overexpression of p53 gene product in brain tumor

의학과/석사[한글] 혈관형성은 신생혈관의 증식을 자극하는 인자들과 이를 억제하는 인자의 평형에 의해 조절이 되는데 종양에서는 자극인자의 분비가 증가되고 억제인자의 분비가 감소하여 혈관생성이 활발하게 일어난다. 종양의 진행에 있어서 정상 세포에서 종양형성유전자 및 종양억제유전자등의 여러 유전변화가 일어나는데 p53 유전자의 돌연변이가 사람에서 생기는 악성종양에 있어서 많은 관련이 있는 것으로 알려져 있으며 p53 유전자의 돌연변이는 암조직내에 혈관형성을 촉진한다는 가설이 제기되고 있다. 본 연구는 51예의 다형성 교모세포종과 20예의 분화형 성상세포종을 대상으로하여 p53 단백과 factor Ⅷ 면역조직화학 염색을 시행하여 p53 단백 과표현과 종양내 혈관형성과의 관계를 알아보고 생존율과의 관계를 알아보고자 하였다. 결과는 다음과 같았다. 1. 분화형 성상세포종에서 p53 유전자 산물의 과표현이 15예(75%)에서 있었고 factor Ⅷ 염색에서 평균혈관수는 200배 시야에서 37.7±9.9개였고 400배 시야에서 17.5±5.8개였다. 2. 다형성 교모세포종에서 p53 유전자 산물의 과표현이 35예(68.6%)에서 있었고 factor Ⅷ 염색에서 평균혈관수는 200배 시야에서 91.9±45.8개였고 400배 시야에서 40.6±19.1개였다. 3. 분화형 성상세포종에서 p53 유전자 산물의 과표현이 있는 경우 평균혈관수가 200배 시야에서 39.4±10.2개, 400배 시야에서 18.9±5.7개였고 없는 경우 200배 시야에서 32.4±7.6개, 400배 시야에서 13.2±3.5개였다. 4. 다형성 교모세포종에서 p53 유전자 산물의 과표현이 있는 경우 평균혈관수는 200배 시야에서 94.5±51.8개, 400배 시야에서 42.1±20.1개였고 없는 경우 200배 시야에서 86.1±29.5개, 400배 시야에서 37.1±16.8개였다. 5. 다형성 교모세포종에서 추적조사가 가능했던 39예중 평균 생존기간은 12.4개월 이었는데 생존율에 영향을 미치는 유효한 지표는 p53 단백 과표현 유무, 환자의 연령 그리고 종양제거술후 보조요법 시행 여부였다. 이상의 결과로 신경교종에 있어서 종양내 신생혈관 형성은 p53 유전자 산물의 과표현 여부와 관련이 있는것으로 생각하였다. 이외에도 다른 종양억제유전자나 종양형성유전자의 영향을 받으며 여러 성장인자들의 측분비 자극도 영향을 미친다. 다형성 교모세포종은 p53 단백 과표현이 나타나는 경우, 환자의 연령이 많을수록 그리고 종양제거술후 방사선 치료나 약물 치료를 받지않은 경우 예후가 나빴다. [영문] Angiogenesis depends on the net balance between positive and negative angiogenic factors. Tumor cells are angiogenic resulting from increased production of positive factors and decreased production of negative factors. Among these, vascular endothelial growth factor and glioma-derived angiogenesis inhibiting factor are related to glioblastoma multiforme. The p53 gene is more frequently mutated than any other known oncogene or tumor suppressor gene in human tumors, including glioblastoma multiforme. Angiogenesis is reported to be controlled by p53 regulation in recent studies. To examine the effect of p53 overexpression on angiogenesis in glioblastoma multiforme, we performed immunohistochemical staining in 51 cases of glioblastoma multiforme, using monoclonal antibodies to p53 protein rind factor Ⅷ, 20 cases of low grade astrocytoma were used as control. The following results were obtained. 1. p53 overexpression was present in 15(75%) of 20 cases of low grade astrocytoma and the mean vessel count was 37.7±9.9 at 200 field and 17.5 ±5.8 at 400 field. 2. p53 overexpression was present in 35(68%) of 51 cases of glioblastoma multiforme and the mean vessel count was 91.9±45.8 at 200 field and 40.7±19.1 at 400 field. 3. Mean vessel count in low grade astrocytoma with p53 overexpression was 39.4 ±10.2 at 200 field and 18.9±5.7 at 400 field, while in cases without p53 overexpession it was 32.4±7.6 at 200 field and 13.2±3.5 at 400 field. 4. Mean vessel count in glioblastoma multiforme with p53 overexpression was 94.5±51.8 at 200 field and 42.1±16.8 at 400 field, while in cases without p53 overexpression it was 86.1±29.5 at 200 field and 37.1±16.8 at 400 field. 5. The mean survival time was 12.4 months in the 39 cases of glioblastoma multiforme in which follow-up studies were possible. Significant prognostic factors were age, p53 overexpression and adjuvant therapy. These results show that p53 gene mutation is one of the many contributing factors to angiogenesis in glioblastoma multiforme. In addition, other oncogenes and tumor suppressor genes, as well as growth factors may be involved. Age, p53 overexpression and adjuvant therapy proved to be significant prognostic factors, while microvessel density was not.restrictio

Amino Acid and Enzyme Assay in Ornithine Transcarbamylase Deficiency

Ornithine transcarbamylase(OTC) deficiency is the most comon genetic enzyme deficiency in the cycle enzymopathy and is inherited as a sex-linked dominant mode. All of the urea cycle enzymopathies may results in the accumulation of ammonia in serum. This produces clinical symtoms such as episodes of vomiting, lethargy, seizure and coma. If hyperammonemia is not controlled, patient will die ultimately. We experienced a case of hyperammoneic coma in a day old male infant. He was confirmed to have OTC deficiency by the enzyme assay of liver tissue.Ornithine transcarbamylase(OTC) deficiency is the most comon genetic enzyme deficiency in the cycle enzymopathy and is inherited as a sex-linked dominant mode. All of the urea cycle enzymopathies may results in the accumulation of ammonia in serum. This produces clinical symtoms such as episodes of vomiting, lethargy, seizure and coma. If hyperammonemia is not controlled, patient will die ultimately. We experienced a case of hyperammoneic coma in a day old male infant. He was confirmed to have OTC deficiency by the enzyme assay of liver tissue

A Case of Idiopathic Pulmonary Hemosiderosis

Idiopathic pulmonary hemosiderosis(IPH) is a relatively rare disease of unknown etiology characterized pathologically by recurrences of intraalveolar pulmonary hemorrhage. Clinical features include hemoptysis, iron deficiency anemia and pulmonary parenchymal infiltrations on chest radiograph. Hemosiderin-laden macrophages are demonstrated by examination of sputum or lung biopsy specimens. We diagnosed IPH by lung biopsy in 9 year-old girl who had had recurrent hemoptysis, iron deficiency anemia and diffuse pulmonary infiltrates on chest radiograph and report this case with brief literature review.Idiopathic pulmonary hemosiderosis(IPH) is a relatively rare disease of unknown etiology characterized pathologically by recurrences of intraalveolar pulmonary hemorrhage. Clinical features include hemoptysis, iron deficiency anemia and pulmonary parenchymal infiltrations on chest radiograph. Hemosiderin-laden macrophages are demonstrated by examination of sputum or lung biopsy specimens. We diagnosed IPH by lung biopsy in 9 year-old girl who had had recurrent hemoptysis, iron deficiency anemia and diffuse pulmonary infiltrates on chest radiograph and report this case with brief literature review