Isolation and characterization of bacteriophages and endolysins targeting Clostridium perfringens

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 농업생명과학대학 식품공학과, 2019. 2. 유상열.Clostridium perfringens is responsible for a variety of diseases in humans and animals. Since incidence of C. perfringens in the poultry industry has been increasing and the prevalence of antibiotic-resistant bacteria has also increased, it has been required to develop alternatives to typical antimicrobial treatments. Bacteriophages are bacterial viruses and endolysins are phage-encoded peptidoglycan hydrolases, and they both have received considerable attention as promising antibacterial agents. In this study, I newly isolated and characterized seven bacteriophages showing lytic activity against C. perfringens. Among these phages, CPD2 had the remarkable thermal stability and CPD7 had inhibition activity against C. perfringens FORC 25, that carries chromosomal cpe gene considered to be the virulence factor responsible for causing the several common gastrointestinal diseases. Thus, they were selected for further study. Bioinformatic analysis of CPD2 and CPD7 genome revealed a putative endolysins, LysCPD2 and LysCPD7, which had homology with N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. The antimicrobial spectrum was relatively broad since LysCPD2 and LysCPD7 could infect not only C. perfringens strains but also other Gram-positive bacteria such as B. cereus and B. subtilis strains. Also, as expected, LysCPD2 retained about 80% of the lytic activity up to 95°C, indicating remarkable thermal stability and LysCPD7 exhibited considerable antimicrobial activity against C. perfringens FORC 25 than LysCPD2. Hence, LysCPD2 was assumed to maintain its activity at the heat-shock condition (75°C for 20 min) for C. perfringens spore germination and it showed significant antibacterial ability against heat- activated germinating spores. Moreover, the bactericidal activity of LysCPD7 against C. perfringens FORC 25 was determined in food such as milk and beef broth. The data presented here suggest that these phages and endolysins can be used as an alternative biocontrol agent for C. perfringens.클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)는 식중독 유발균으로서 인간과 동물에 감염하여 다양한 질병을 유발할 수 있다. 특히, 항생제 내성의 확산을 막기위해 성장촉진용 항생제의 사용을 금지한 여러 유럽 국가에서 가금류의 클로스트리디움 퍼프린젠스로 인한 발병 증가로 인하여 기존의 항생제를 대체할 수 있는 새로운 항세균제제의 개발이 필요하다. 박테리오파지 및 파지에서 분리된 세포벽 분해 효소인 엔도라이신은 병원균에 대해 특이적으로 작용하고 내성균 생성 확률이 적어 새로운 항생물질로서 각광받고 있다. 본 연구에서는 클로스트리디움 퍼프린젠스를 감염할 수 있는 7개의 파지를 분리하고 그 특성을 분석하였다. 그 중에서 내열성이 뛰어난 CPD2와 주요 병원성 유전자에 속하는cpe 유전자를 가진 균주를 제어할 수 있는 CPD7을 선정해 엔도라이신 실험을 진행하였다. CPD2와 CPD7의 유전자를 분석한 결과 엔도라이신으로 추정되는 유전자를 밝혀냈고, 이들은 기존의 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase와 상동성을 보였다. 각각의 엔도라이신 LysCPD2와 LysCPD7은 모두 클로스트리디움 퍼프린젠스 뿐만 아니라 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에도 제어효과를 보였다. 또한 예상한 바와 같이 LysCPD2는 95°C에서 80%의 활성을 유지하여 뛰어난 내열성을 나타냈다. LysCPD2의 내열성을 바탕으로 포자를 발아 조건인 75°C에서 20분간 LysCPD2와 함께 배양하였고, 열에 의해 활성화된 포자에 대해 항균 능력을 확인하였다. 덧붙여 LysCPD7은 LysCPD2보다 클로스트리디움 퍼프린젠스 FORC 25 균주에 대해 높은 용해능을 보였고, 우유와 고기육수에서도 항균 활성을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어 실험에 사용된 파지와 엔도라이신이 클로스트리디움 퍼프린젠스를 제어할 수 있는 새로운 미생물 제어 방안으로서 가능성을 가진 물질임을 알 수 있었다.ABSTRACT.....................................................................................................i CONTENTS..................................................................................................iii List of Figure..................................................................................................vi List of Table..................................................................................................vii Ⅰ. INTRODUCTION..................................................................................1 Ⅱ. MATERIALS AND METHODS...........................................................5 1. Bacterial strains and growth condition........................................5 2. Isolation and bacteriophages........................................................5 3. High-titer stock preparation of bacteriophages..........................6 4. Transmission Electron Microscopy (TEM) Analysis..................7 5. Bacterial-challenge test in liquid culture.....................................7 6. DNA purification and whole genome sequencing of bacteriophages................................................................................8 7. Endolysin production....................................................................9 8. Lytic activity assay.......................................................................10 9. Antimicrobial activity of LysCPD7 in food samples.................12 10. Amidase assay............................................................................12 11. Spore preparation and purification.........................................13 12. Nucleotide sequence accession number....................................14 13. Statistical analysis.....................................................................14 Ⅲ. RESULTS..........................................................................................15 1. Isolation and host ranges of bacteriophages.................................15 2. Morphology of the phages and challenge assay...........................17 3. Thermal stability of the phages..................................................20 4. Genome analysis of the phages...................................................21 5. Identification and expression of endolysins...............................23 6. Antimicrobial spectrum of the endolysins.................................29 7. Effects of NaCl, pH, and temperature on the endolysins..........31 8. Determination of thermal stability.............................................33 9. Antibacterial ability of LysCPD7 against C. perfringens in milk and beef broth..................................................................................35 10. Antibacterial ability of endolysins against heat-activated spores...............................................................................................38 Ⅳ. DISCUSSION.......................................................................................40 Ⅴ. REFFERENCES..................................................................................43 국문초록.......................................................................................................49Maste

The Role of Corporations in the U.S.·Japan Automobile Trade Negotiations : Focusing on Toyota Motor Corporation

Economic tensions among advanced industrialized countries have become increasingly significant as a major cause of international conflicts and confrontations in the Post-Cold War era. Such tensions are even more important for the world’s major economic powers, such as Japan and the United States, which lead the global political and economic trends. Trade disputes between the U.S. and Japan have lingered since the 1950s and are yet to be resolved. The trade friction between the two countries, however, escalated in the 1980s, in particular, when the U.S. economy slowed down, whereas Japan continued its economic growth. In other words, the biggest reason for the U.S.-Japan economic tension consisted was America’s weakened standing in world politics, military, and economy. The hard lines that both nations took during the U.S.-Japan Automobile Negotiations in the 1990s gave their relations a new meaning. Despite its successful economic growth in the 1980s, Japan showed a passive approach to international relations. The Japanese government made a unilateral decision to accept U.S. demands during the negotiations. In the 1990s, however, Japan adopted an entirely different attitude. The government began to collaborate with companies, allowed them to handle other issues than the restrictions on repair parts, and clearly expressed refusal in certain matters. Japan also opposed the numerical target demanded by the U.S. on the grounds that their demand contradicted the international trade order based on free trade. The purpose of this research is to analyze the role of corporations in the U.S.-Japan automobile negotiations in 1995. In order to ease the friction and to conclude the negotiations, Japan’s five biggest automakers including Toyota actively cooperated with the Japanese government. The study stressed that such active corporate cooperation changed the results of the negotiations. To analyze the role of those enterprises, the classification of changes in the Japanese government-corporate relations has been used. Consequently, the research found a shift in leadership from the government in the 1980s to corporations in the 1990s. It is due to Japan’s national reform in the 1980s that the enterprises were able to actively cooperate with the government. The enterprises assumed an important role as the profitable political system based on the coalition among the government, public organizations, and industry became problematic due to the international factors, such as the 1980s economic tensions, foreign pressure to open up its market, and the demand for Japan to make international contributions. As the efforts made by the government highlighted the enterprises’ role, Japan’s automobile makers in the 1990s announced autonomous management plans and tried to make direct contact with the U.S.- Toyota, in particular, presented the target parts purchase on behalf of all Japanese automobile makers and urged the U.S. side to accept its proposals to expand production and increase imported car sales agencies in the U.S. This study conducted a specific case analysis of Toyota’s proposals. At present, South Korea is also under pressure to open up its automobile market. The following are Japan’s policies of which Korea should take note: First, it is worthy of note that the Japanese government and enterprises fully cooperated in most issues. For example, they made a concerted effort to purchase imported parts, allow affiliated dealers to sell imported cars, and expand the types of cars handled in repair factories. Second, the government and the enterprises voluntarily continued to eliminate pressing problems before the U.S. increased pressure to open up markets. Japan expanded the purchase of parts through the MOSS agreement and gradually succeeded in establishing a unified certification testing system. Third, the Japanese government and enterprises were confident enough of their own competitive power to open up its automobile market. This implies that enhanced competitiveness is the only way to win economic, whether a country opens up its economy or not. Korean should learn from Japan’s success to improve its competitiveness and cope more actively with competition through the government-corporate relations. While the automobile industry in Korea is heavily dependent on trade with the U.S. it suffered difficulties during the U.S.-Korea FTA negotiations. To avoid trade friction and continue its economic growth, Korea should promote the relations between its government and companies.;선진공업국간의 경제마찰은 냉전종식이후 국제사회의 분쟁과 대립의 주요인으로서 그 중요성이 배가되어왔다. 특히 현재 경제대국으로서 국제정치경제질서의 흐름에 주도적인 역할을 담당하고 있는 미국과 일본에게 있어서는 그 중요성이 더욱 두드러지는 것이다. 미-일간의 무역 분쟁은 1950년대부터 있어온 현상으로 오늘날 새삼스러운 일은 아니다. 그러나 1980년대부터 일본의 지속된 경제성장에 반하여 미국의 경제가 상대적으로 저하하면서 양국의 무역문제에서 마찰은 과거에 비하여 심화되었다. 즉 양국의 경제마찰의 최대원인은 정치-군사-경제 등의 제 분야에서 확보되고 있었던 미국의 압도적인 지위가 흔들린데 있었던 것으로 볼 수 있다. 1990년대 미-일 자동차협상에서 양국이 보여줬던 초강경대응은 이러한 관점에서도 그들 관계에 대한 새로운 의미를 보여주는 것이 되었다. 1980년대 일본은 경제성장을 이루었지만, 국제관계에서 여전히 소극적인 태도를 보였다. 자동차 협상과정에서 일본정부는 기업과의 협의 없이 미국의 일방적인 요구를 받아들였다. 반면 1990년대 일본은 대응방식이 달라졌다. 정부와 기업은 손을 잡고, 보수용 부품시장의 규제조치 이외의 문제는 기업에게 자율적으로 맡기며, 미국의 공평하지 못한 요구에 거부의사를 명확히 밝혔다. 또한 미국의 수치목표 요구는 자유무역주의에 기반한 국제무역질서를 위반하는 관리무역에 해당된다며 반대하였다. 본 연구의 목적은 1995년 체결된 미국과 일본의 자동차협상과정에서 기업의 역할을 분석하는 것이다. 마찰완화 및 협상타결을 위해 도요타자동차를 비롯한 일본 5대 자동차기업이 일본정부에 적극 협조하였다. 이것을 토대로 기업의 협조가 적극적으로 변하면서, 협상과정과 결과도 변화하였다는 점에 중점을 두었다. 기업의 역할을 분석하기 위해 정부와 기업 관계변화 유형화를 분석틀로 제시하여, 1980년대에는 정부주도에서 1990년대 기업주도로 변화하였다는 것을 밝힐 수 있었다. 이와 같이 기업이 정부에 적극 협조할 수 있었던 배경에는 1980년대 일본의 국가개혁을 우선으로 들 수 있다. 1980년대의 경제마찰과 외국으로부터 시장 개방 압력, 일본의 국제적 공헌 요구 등의 국제적인 요인에 의해, 정·관·재의 연합을 중심으로 하는 이익 정치시스템, 그 자체가 문제화되면서 기업의 역할이 중요시되었다. 이러한 정부의 노력으로 기업의 역할이 부각되었다. 본 연구에 규정한 기업의 역할은 다음과 같이 2가지이다. 첫째로 미국 정부와 일본 정부의 중계자의 역할을 자처하여 동맹관계 강화에 전력하였다. 두 번째로 협상과정에서 협상제안자의 역할을 수행하였다. 일본정부를 대신하여 자주경영계획을 발표하고, 점정조직을 만들어 미국과의 직접적인 접촉을 시도하였다. 특히 도요타자동차회사는 일본자동차기업을 대표하여 부품구입에 대한 목표 제시, 미국현지생산 확대, 수입차 판매 대리점 증강할 것을 직접 제시하여 미국 측에서 받아들이도록 하였다. 이러한 도요타자동차의 제안을 구체적인 사례를 통하여 분석하였다. 우리나라도 현재 자동차에 대한 개방 압력을 겪고 있는데, 일본의 대응정책중 주시해야 할 것을 나열하면 다음과 같다. 첫째. 일본정부와 기업은 대부분의 사안에 대해 협력을 아끼지 않았다는 점을 들 수 있다. 외국부품 구입노력, 계열딜러들로 하여금 수입차 판매를 허락한 점, 정비공장의 취급차종을 확대한 점 등 각종 사안에 대하여 정부와 기업이 보조를 맞추고 있는 점이 눈에 띈다. 둘째. 미국의 시장 개방 압력이 가중되기 전에 자발적으로 정부와 기업이 압력요인을 제거해 나갔다는 점을 둘 수 있다. MOSS협의를 통해 부품구입확대를 행하고 있었다든지, 표준,인증 검사 항목에 대한 통일을 지속적으로 해결해왔다는 점 등은 이러한 사전에 압력요인을 줄일 수 있는 조치라고 할 수 있다. 셋째. 일본정부와 기업이 자신감을 가지고 시장개방을 할 수 있을 정도로 경쟁력에 자신이 있다는 점이다. 결국 시장개방의 유무에 관계없이 경쟁에서 이기는 길은 경쟁력 제고 밖에 없다는 점을 말해준다고 하겠다. 일본의 경우를 통해 정부와 기업 간의 상호교류를 통해 경쟁력을 쌓고, 능동적으로 대처해야 할 것이다. 현재 우리나라의 자동차산업은 미국에 집중되는 반면, 자동차수입은 크게 증가하지 않아 미국과의 FTA에서 난항을 겪었다. 한국이 통상마찰을 피하고 계속 발전하기 위해서는 정부와 기업이 상호 교류하여 관계를 유지하는 것이 바람직하다.;先進工業国間の経済摩擦は冷戦の終息の後、国際社会の紛争と対立で主な要因として、その重要性が倍加してきた。特に、現在、経済大国として国際政治経済の秩序の流れに主導的な役割を果たしているアメリカと日本にとっては、その重要性はなお一層際立ったものとなっている。米⦁日間の貿易紛争は1950年代から続けってきた現象で、今日になって新たに取り上げられるものではない。 しかし、1980年代から始めた日本の持続的な経済成長に比べ、アメリカの経済は相対的に低下し、両国の貿易問題においての摩擦は深化してきた。すなわち、両国の経済摩擦の最大の原因は、政治・軍事・経済などの諸分野において確保されていたアメリカの圧倒的な地位が揺らいだことにあったと考える。1990年代米日自動車協商で両国が見せた極めて強硬な対応は、このような観点からもその関係に関する新たな意味を示すものとなる。 1980年代日本は経済成長を遂げたが、国際関係においては相変わらず消極的な態度を見せた。自動車の協商過程で日本政府は、単独主導でアメリカの一方的な要求を受け入れた。 しかし、1990年代、日本の対応方式は変化した。政府と企業は手をつなぎ、補修用部品市場の規制措置以外の問題は企業に自律的に任せ、アメリカの公平でない要求を拒否する意思を明らかにした。 また、アメリカの目標数値の要求は、自由貿易主義を基盤とした国際貿易秩序に違反する管理貿易に該当するとして反対した。 本研究の目的は、1995年に締結されたアメリカと日本の自動車協商過程における企業の役割を分析することである。摩擦緩和および協商妥結のためにトヨタ自動車をはじめとした日本の5大自動車企業は日本政府に積極的に協力した。企業の協力が積極的に変化したことで、協商の過程と結果も変化したという点に重点を置いた。 企業の役割を分析するために、政府と企業の関係変化の類型化を分析のフレームワークとして提示し、1980年代の政府主導から1990年代は企業主導に、変化したということを明らかにすることができた。 このような企業が政府に積極的に協力することができた背景には、まず1980年代の日本の国家改革を挙げることである。1980年代の経済摩擦と外国からの市場開放の圧力、日本への国際貢献の要求などの国際的な要因によって、政・官・財の連合を中心とする利益政治システム、それ自体が問題化したことで、企業の役割が重要視されてきた。 このような政府の努力により、企業の役割が浮上する事が出来、1990年代の日本の自動車企業は自主経営計画を発表し、暫定組織をつくってアメリカとの直接的な接触を試みた。 特に、トヨタ自動車会社は日本の自動車企業を代表して部品購入に対する目標を提示、アメリカ現地生産の拡大、輸入車販売代理店の増強を直接に提示して、アメリカ側で受け入れられるようにした。このようなトヨタ自動車の提案を具体的な事例を通して分析した。 現在、韓国も自動車に対する開放の圧力を受け入れているが、日本の対応政策のうち注視すべきことを挙げるならば、次のとおりである。 第一に、日本政府と企業は大部分の事案について協力を惜しまなかったという点を挙げることができる。外国部品の購入努力、系列ディーラーに輸入車販売を許可した点、整備工場の取り扱い車種を拡大した点など、各種の事案について政府と企業が足並みを合わせている点が目立つ。 第二に、アメリカの市場開放の圧力が加重する前に、自発的に政府と企業が圧力の要因を取り除いていったという点を挙げることができる。MOSS協議を通じて部品購入拡大を行っていたことや、標準・認証検査項目に関する統一を持続的に解決してきたという点などは、そのような事前に圧力の要因となるものを減らすための措置だということができる。 第三に、日本政府と企業が自信を持って市場開放をすることができるほど競争力に自身を持つことだ。結局のところ市場開放の有無とは関係なく競争に勝つ道は、競争力を高める以外にないという点を語っていると言えよう。日本のケースを通じて、政府と企業の間の相互交流によって競争力を高め、能動的に対処すべきであろう。 現在、韓国の自動車産業はアメリカに集中している反面、自動車輸入は大きく増加しておらず、アメリカとのFTAで難航を経た。韓国が通商摩擦を避けて発展し続けるためには、政府と企業が相互交流しながら関係を維持することを望ましい。Ⅰ. 서론 1 A. 문제제기와 연구배경 1 B. 연구 목적 2 C. 기존연구검토 및 연구방법 4 D. 연구 방법과 연구 구성 9 Ⅱ. 일본의 행정지도와 정부-기업관계 11 A. 행정지도를 통한 정부-기업관계 13 1. 행정지도 개념 13 2. 정책수단으로서 행정지도의 성격 14 B. 산업정책에서의 정부-기업관계 16 1. 관민협조체제의 성립 배경 16 2. 산업정책의 정부-기업관계와 행정지도 17 C. 정부-기업 관계변화를 위한 분석 유형화 19 1. 정부의 영향력 20 2. 기업의 영향력과 역할 22 3. 정부-기업 관계 분석 유형화 23 Ⅲ. 자동차협상을 통해 본 정부-기업관계 변화과정 26 A. 1980년대 자동차협상과정에서 정부-기업관계 분석 26 1. 정부의 권위적 통치 26 2. 기업의 소극적 대응 31 B. 1990년대 자동차협상에서의 정부-기업관계 분석 32 1. 정부정책의 전환 32 2. 기업의 전략적 대응 37 Ⅳ. 1995년 미·일 자동차협상과정에서 기업의 역할 42 A. 미·일 자동차협상과정 전개 42 B. 도요타자동차의 역할 49 1. 통상 전개과정에서의 도요타의 약진 49 2. 통상 협상과정에서의 도요타의 제안 53 3. 도요타자동차의 ‘신 국제비지니스 플랜’ 59 Ⅴ. 결론 66 참고문헌 69 Abstract 75 論文槪要 7

Formalin으로 유도된 통증 모델에서 capsaicin 약침의 통증 억제 효과

Dept. of Medical Science/석사Acupuncture combined with pharmaceutical agents has been used to treat diseases in humans and animals. Capsaicin, the active element in hot chili peppers, has selective actions on unmyelinated C-fibres and thinly myelinated A primary sensory neurons. Capsaicin induces depolarization of nerve cell by intracellular accumulation of cation. However, high concentration of intracellular calcium ion is known as voltage sensitive cation channel’s blocker for long time. As a result, continuous intracellular accumulation of cations induce desensitization of nociceptive neuron. This implies capsaicin may be used to relieve pain as one of pharmaceutical agents which can be combined with acupuncture. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) is based upon neuronal activity-dependent manganese (Mn) uptake which can provide useful information about functions of the nervous system. However, no systematic studies regarding processing of pain using MEMRI have not been conducted. The present study was conducted to determine whether capsaicin acupuncture as one of pharmaceutical acupuncture can relieve pain effectively, using formalin test, MEMRI, and c-Fos immunohistochemistry in rats. Male Sprague-Dawley rats (230 ~ 250 g) were used in this study. For MEMRI investigation, MnCl2 solution (50 ㎕) was injected into subarachnoid space. After then, capsaicin was injected by concentration (0, 0.1, 1, and 2%) at the Zusanli (ST36) acupoint of the left leg. Formalin solution (5 %, 50 ㎕) was injected into the plantar side of left hind paw and pain-related behavior (flinching) was immediately observed for 1 hr. After behavioral test, MEMRI was performed in a Biospec 4.7 T MRI system. For analyzing MnCl2 distribution, a set of noncontiguous T1-weighted (T1W) images were acquired. Lastly, immunohistochemistry was performed to observe c-fos expression. Capsaicin injected at ST36 acupoint inhibited formalin-induced pain behaviors. In formalin test, flinching behavior of high concentration capsaicin-injected rats was significantly reduced compared to 0% capsaicin-injected group. MEMRI results showed difference of intensity induced by manganese ion between formalin only treated group and capsaicin treated group. In addition, c-Fos expression level was effectively decreased in capsaicin-treated group compared to formalin only treated group. In conclusion, this experiment using formalin test, MEMRI and c-Fos immunohistochemistry support that capsaicin can reduce formalin-induced pain. It suggests that capsaicin acupuncture as one of pharmaceutical acupunctures may be effective in relieving pain.restrictio

성인 고형암 환자의 고칼슘혈증 치료현황과 치료효과 분석

Background: Hypercalcemia is an important metabolic emergency condition in cancer patients. Bisphosphonate is the treatment of choice for hypercalcemia, whereas calcitonin and hydration with furosemide are recommended for acute supportive therapy