신규 디스인테그린(saxatilin)의 평활근 세포증식 억제 기전

Dept. of Medical Science/박사[한글] 동맥경화 치료를 위한 관상동맥 풍선도자성형 시술 환자의 30-40%에서 혈관의 재협착이 발생한다. 동맥혈관벽의 재협착에 있어서 신생조직의 발달에 혈관 평활근세포의 자극이 매우 중요한 과정으로 인식되고 있다. RGD 서열를 함유하고 있는 펩타이드들은 신생내막증식에 관여하는 beta3-인테그린류인 alphaIIbbeta3나 alphav beta등과 결합하여 목표하는 리간드와의 결합을 길항하는 것으로 보고되고 있다. 대부분의 디스인테그린은 혈소판 피브리노젠 수용체인 GPIIb-IIIa, alphav beta3과 alpha5beta1등에 의해 인식되는 motif인 RGD 또는 KGD서열을 포함하고 있다. 본 연구의 목적은 한국산 칠점사의 독으로부터 분리된 새로운 디스인테그린인 saxatilin의 생물학적 활성을 규명하고자 효모로부터 대량생산을 시도하였다. Pichia pastoris 효모의 배양액에서 phenyl-Sepharose와 RPC-HPLC 크로마토그라피의 조합으로 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합 saxaxlin을 균일상태로 순수 정제하였다. 이때 수율은 리터당 약 150mg이 도달했으며 이 재조합 단백질의 생물활성과 분자적 특성이 천연물에서 얻은 것과 동일함을 확인하였다. 이 재조합 saxatilin은 인테그린 alphavbeta3에 반응하여 인간의 관상동맥유래 평활근세포와 vitronectin과의 결합을 강하게 저해했으며 IC50 농도는 2.5uM이었다. 세포성장인자들에 의한 세포의 증식억제 IC50 농도는 PDGF-BB 또는 bFGF에 대하여 약 25uM로 측정되었다. Saxatilin은 focal adhesion의 actin 세포골격망을 분해시키고 세포의 형태를 변형시켜 부착이 저해되도록 작용하지만, 이 같은 세포의 형태수축이 일어나는 동안 미세 tubulin 구조의 변화는 일으키지 않았다. 이러한 focal adhesion의 해체과정에서 caspase효소에 기인된 paxillin의 분해가 관여하는 것으로 확인되었다. Saxatilin을 처리한 세포에 일시적인 FAK와 ERK 인산화가 일어났으며, 세포주기조절에 관여하는 CDK저해단백질 (p21, p27)은 증가하지만 cyclin들 (D1/2, E)은 오히려 감소하는 경향을 보였다. 또한, saxatilin을 처리하지 않은 평활근세포가 정상적으로 성장하는 동안 saxatilin처리 세포는 시간경과에 따라 세포탈착(anoikis)에 이르게 하였다. 이상의 결과들은 동맥경화와 혈관재협착 과정에 중요한 평활근 세포의 신생내막증식 과정에서의 인테그린의 병리생리학적 역할에 대한 새로운 여러가지 정보를 제공하고 있다. 또한, 특정 인테그린에 대한 길항제를 이용한 동맥경화의 예방과 혈관재협착의 치료에 이와 같은 정보가 유용하게 활용될 수 있으며 동물시험을 통한 생체 내 활성이 입증된다면 saxatilin이 신약개발의 좋은 모델물질로 인식될 것으로 기대된다. [영문]Restenosis occurs in approximately 30-40% of patients following percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) for treatment of atherosclerosis. The stimulation of vascular smooth muscle cell is critical steps in the development of the neointimal tissues that contribute to restenosis of arterial wall. RGD-containing peptides are able to inhibit the binding of ligands to certain beta3 integrins,alphaIIbbeta3, and alphavbeta3, both of which are involved in the neointimal hyperplasia. Most of the disintegrins contain Arg-Gly-Asp (RGD) or Lys-Gly-Asp (KGD) sequence, which is a structural motif recognized by the platelet fibrinogen receptor GP IIb-IIIa, alphavbeta3, and alpha5beta1. The purpose of this study was to examine the biological effects of saxatilin, a novel disintegrin from the venom of a Korean snake (Gloydius saxatilis) on vascular smooth muscle cells. To perform this work we first needed to express and produce large amounts of the active form of recombinant saxatilin in yeast Pichia pastoris. The recombinant saxatilin was highly expressed as a biologically active form in Pichia pastoris, and it was successfully purified from the culture media to be homogeneity by the combination of a phenyl-Sepharose chromatography and a reverse-phase HPLC. The overall yield was approximately 150 mg/L. The molecular and biological properties of the purified recombinant protein were almost same with its natural from. It interacted with integrin alphavbeta3, and significantly suppressed the adhesion of human coronary artery smooth muscle cells (HCASMC) to vitronectin with an IC50 of 2.5uM. Half maximal-inhibited concentration of saxatilin for growth factors (PDGF-BB or b-FGF) induced-proliferation was an approximately 25uM. Saxatilin disassembled actin cytoskeleton of focal adhesion and induced cells to being rounded and detached, but did not alter microtubule structure in the early stage of cells to being shrunk. This disassembly of focal adhesion in saxatilin-treated HCASMCs involved caspase-induced paxillin degradation. Focal adhesion kinase (FAK) and ERKs of saxatilin-treated SMCs were temporally phosphorylated. Saxatilin affected cell cycle progression of HCASMCs by increasing CDK inhibitors (p21 & p27) and reducing cyclins (D1/2 and E). While SMC was proliferated normally on plates without saxatilin, cells treated with saxatilin eventually underwent anoikis. These results may provide new insights into role of integrin in SMC pathophysiology as well as role of SMCs in the process of neointimal hyperplasia and also suggest significant implications for integrin antagonistic therapy of the treatment for arteriosclerosis and restenosis.ope

유전 공학을 이용한 CHO 세포에서 재조합 에리스로포이에틴의 시알산 증진

학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과, 2010.08, [ viii, 96 p. ]The importance of sialic acids, which are occupied the terminal sites of \It{N}-linked glycans in glycoproteins, is well known from many researches. The galactose-exposed glycoproteins are cleared rapidly from blood streams by capturing asialoglycoprotein receptors in hepatocytes. Therefore we explored to maximize the sialylation of human erythropoietin by genetic engineering of sialylation pathway in CHO cells. Sialylation is catalyzed by the various sialyltransferases using CMP-sialic acid as an active sugar donor in lumen of the Golgi apparatus. Thus, the activity of sialyltransferase is the key factor to determine the sialylation level of glycoproteins. In this study, we compared the effect of various sialyltransferase overexpression in rhEPO-producing CHO cells. Different from the human cells, Chinese hamster cells lack the genes encoding $\alpha$2,6-sialyltransferase ($\alpha$2,6-ST). Thus, human $\alpha$2,6-ST was overexpressed in CHO cells to produce the much human-like glycoproteins. Chinese hamster $\alpha$2,3-ST was overexpressed to demonstrate the necessity of signal peptide for the localization of sialyltransferase. The sialic acid content of rhEPO which produced from Chinese hamster $\alpha$2,3-ST overexpressed CHO cells showed the similar increment as compared that of human $\alpha$2,3-ST overexpressed CHO cell lines. The sialic acid contents of rhEPO was most significantly increased when the human $\alpha$2,3-ST and human $\alpha$2,6-ST was overexpressed simultaneously up to 20.4%. The sialic acid content of rhEPO produced from EC2-1H9-H26ST 8 cell lines was increased up to 13.0%. The overexpression of human $\alpha$2,6-ST in CHO cells typically showed the much higher increment of sialic acid contents in produced rhEPO. However, there were various reports about the effect of $\alpha$2,6-linked sialic acid in pharmacokinetics of therapeutic glycoproteins. Thus, the accurate effects and functions of $\alpha$2,6-linked sialylation have to be de...한국과학기술원 : 생명과학과

Method for preparing recombinant glycoproteins with highcontent of sialic acid

본 발명은 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 263번 아미노산인 아르기닌을 류신으로 치환하거나, 또는 263번 아미노산인 아르기닌을 류신으로 치환하고 266번 아미노산인 아르기닌을 글루타민 또는 트립토판으로 치환하여 점 돌연변이를 유도한 UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase(GNE/MNK) 효소는, 시티딘모노포스페이트(cytidine monophosphate, CMP)-시알산의 농도에 상관없이 에피머라제(epimerase)의 활성이 지속적으로 유지되고, 이를 과발현시킨 세포는 세포 내 CMP-시알산의 함량이 증가하며, 특히, 상기 점 돌연변이가 유도된 GNE/MNK, 인간 알파-2,3 시알산당전이효소 및 CMP-시알산 수송단백질 유전자를 동시에 과발현시킨 당단백질(에리스로포이에틴 또는 트롬보포이에틴) 생산 숙주세포에서는 세포 내 CMP-시알산 및 당단백질의 시알산 함량이 증가하므로, 상기 3가지 유전자의 시알산결합을 가진 재조합 당단백질 생산 숙주세포에서의 과발현은 시알산 함량이 증가된 당단백질의 제조에 유용하게 이용될 수 있다

A Kit for Analyzing Glycoprotein and Uses thereof

본 발명은 형광표지된 항체, 형광표지된 생체물질 및 지지체를 포함하는 당 단백질 분석용 키트, 상기 키트를 이용하여 당 단백질의 함량 및 당화 특성을 동시에 정량분석하는 이중 탐침법, 상기 키트를 이용하여 목적하는 당화 특성을 갖는 당단백질을 생산하는 단일세포를 선별하는 방법 및 상기 방법으로 선별된 목적하는 당화 특성을 갖는 당단백질을 생산하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 당 단백질 분석용 키트를 이용하면, 단일세포가 생산하는 당 단백질의 양과 상기 당 단백질에 포함된 탄수화물 영역의 함량을 동시에 분석할 수 있고, 특정 탄수화물의 함량을 분석할 수 있으며, 목적하는 당화 특성을 갖는 당 단백질을 생산하는 세포를 선별할 수 있으므로, 산업적으로 가치 있는 당 단백질의 개발 및 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다