PartⅠ. Studies on the light-regulated DNA binding proteins, PartⅡ. Synthesis and biological evaluations of novel peptidomimetic compounds

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과, 2014. 8. 이지연.본 논문은 두 가지 주제를 포함하고 있으며, PartⅠ에서는 빛에 의해 조절되는 유전자 결합 단백질에 관한 연구를 서술하였으며 Chemistry - A European Journal 2014년 2월에 발표된 논문을 근거로 작성하였다. 그리고 PartⅡ에서는 신규 peptidomimetic compound의 합성과 항암 활성 연구 내용을 서술하였다. [PartⅠ] 단백질 기능을 조절하기 위해 광학기법을 이용하게 되면 생체 시스템에서 시공간적으로 정밀하게 기능 조절이 가능하며, 세포 내부의 다른 요소에 부작용을 일으키지 않고 정상 프로세스를 유지한 상태에서 원격 조정이 가능한 장점을 가진다. 이러한 점을 바탕으로 본 연구에서는 신규 융합 단백질인 As-LOV-Tet repressor(TetR)와 YtvA-Tet repressor(TetR)를 디자인하여 빛에 의해 단백질의 기능을 조절할 수 있도록 하였으며, 이에 대한 Thermodynamic, Kinetic 특성을 규명하고자 하였다. Flavin mononucleotide (FMN)에 의해 빛이 흡수되면 Light sensing domain인 As-LOV와 YtvA을 통하여 TetR 단백질에 신호를 전달하게 되어 TetR 단백질과 결합하는 Ligand인 Tetracycline과의 결합력이 변화하게 된다. 본 연구를 통해 제작된 빛에 반응하는 단백질 모듈은 단백질 신호전달 메커니즘에 대해 심도 있는 이해를 할 수 있는 중요한 방법을 제시하였다. 또한 빛에 의해 민감하게 구조 변화를 일으키는 단백질 모듈을 다른 단백질과 조합하여 빛에 의한 항생제의 반응성을 조절함으로써 새로운 치료제 개발 전략 확립에 기여할 수 있을 것으로 기대된다. [PartⅡ] 펩타이드 골격 화합물은 수많은 작용기를 이용한 라이브러리 합성이 가능하며 세포 내부에 존재하는 peptidase에 의해 쉽게 분해될 수 없기 때문에 높은 안정성을 가진다. 이러한 장점들 때문에 많은 연구가 이루어지고 있으며, 다양한 요소에서 효능을 기대할 수 있다. 본 연구에서는 펩타이드 유사 구조인 peptoid를 기반으로 하여 Library를 구축하였고 화합물에 대한 characterization을 진행하였으며 생물 활성 실험을 진행하였다. 이를 통하여 몇 가지 화합물이 인간 폐암세포 (H1299)에서 억제 효과가 있는 것을 확인하였고 농도 의존적으로 효과가 증가하는 것을 알 수 있었다. 추가적으로 분자 모델링 연구를 통해서 IGF-1R Kinase 수용체의 활성자리에서 합성한 화합물이 리간드로서 상호작용하는 양상을 확인할 수 있었으며, 기존에 알려진 활성 억제제에 비교할만한 수준의 작용을 하고 있음을 확인할 수 있었다. 앞으로 추가적인 효과 검증을 위하여 구체적인 binding mode를 규명하고자 하며 이를 바탕으로 하여 더욱 강력한 효능이 있는 효소억제제를 합성할 수 있을 것으로 기대된다.국문초록 ⅰ 목차 ⅲ 표목차 ⅴ 그림목차 ⅴ Scheme 목차 ⅴ 약어 목록 ⅵ [Part Ⅰ] 제 1 장 서론 1 제 2 장 실험 결과 5 제 1 절 단백질 디자인 5 제 2 절 Chimeric 단백질의 Dark regeneration kinetics 7 제 3 절 Electrophoretic mobility shift assay 9 제 4 절 형광(Fluorescence) Spectroscopy 11 제 5 절 Stopped-flow 분석 13 제 6 절 Tetracycline에 대한 평형해리상수 15 제 7 절 Circular dichroism 16 제 3 장 실험 방법 18 제 1 절 클로닝 18 제 2 절 단백질 발현과 정제 18 제 3 절 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay) 19 제 4 절 형광(Fluorescence) 측정 21 제 5 절 동역학적 분석(Stopped-flow) 21 제 6 절 Circular dichroism 22 제 4 장 결론 및 고찰 23 [Part Ⅱ] 제 1 장 서론 25 제 2 장 실험 결과 28 제 1 절 합성 결과 28 1-1. A 타입 화합물 28 1-2. B 타입 화합물 30 1-3. 수율 및 정성 분석 결과 32 제 2 절 항암 활성 평가(MTT assay) 34 제 3 절 Western blot analysis 36 제 4 절 분자 모델링 연구 38 제 3 장 실험 방법 40 제 1 절 실험재료 40 제 2 절 합성 40 제 3 절 항암 활성 평가(MTT assay) 42 제 4 절 Western blot analysis 42 제 5 절 분자 모델링 연구 43 제 4 장 결론 및 고찰 44 참고문헌 45 Appendix 54 Abstract 62Maste