마이크로RNA 생합성의 대안적 경로에 관한 연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 자연과학대학 생명과학부, 2021.8. 김빛내리.마이크로RNA는 유전자들의 발현을 조절함으로써 다양한 생물학적 및 병리학적 현상들을 담당한다. 세포 유형별로 마이크로RNA의 양이 상이하게 다른데, 이는 전사 조절과 전사 후 조절을 통한 생합성 조절에 기인한다. 마이크로RNA 생합성 경로는 다양한 과정을 걸쳐 이루어지는데, 그 결과 머리핀 모양의 구조를 포함하는 기다란 1차 전구체 RNA로부터 단일 가닥의 짧은 마이크로RNA가 생성된다. 특히, 마이크로RNA 생합성에는 다양한 대안적 경로들이 존재하는데, 그로 인해 동일한 전구체 RNA로부터 서로 다른 마이크로RNA들이 만들어진다. 따라서 대안적 경로들은 마이크로RNA의 다양성을 증가시키고 기능을 확대하는데 의의가 있다. 하지만 어떤 마이크로RNA가 대안적 경로에 의해 생성되는지 전사체학 수준에서 알려진 바가 없다. 또 대안적 경로들에 관한 조절이 잘 알려져 있지 않다. 먼저 본 연구에서는 대표적인 대안적 경로인 ‘대안적 절단’과 ‘유리딘화 현상’에 관해 조사하였다. 두 현상은 마이크로RNA의 5′ 및 3′ 말단에 변화를 가하는데, 이는 마이크로RNA의 기능을 바꾸거나 양을 조절할 수 있다. 마이크로RNA 서열 분석법은 사전 정보 없이도 마이크로RNA와 그 동형체들을 알아낼 수 있어 전사체학 수준에서 마이크로RNA를 연구하는데 널리 이용되어 왔다. 하지만 기존의 방법은 심각한 편향성을 가지고 있어서 마이크로RNA의 대안적 경로를 조사하기에는 부적절하였다. 따라서 본 연구에서는 그 편향성을 최소화하기 위해 무작위적 서열을 지닌 어댑터와 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 조건을 최적화하였고, 그 결과 AQ-seq이라는 새로운 마이크로RNA 서열 분석법을 개발하였다. AQ-seq은 가닥 비율을 정확히 측정할 수 있을 뿐만 아니라 기존에 잘못 알려진 5′ 말단을 정확하게 탐지할 수 있다. 이러한 이점 덕분에 AQ-seq은 세포 내에서 일어나는 대안적 절단 과정이 기존에 알려진 것보다 더 빈번하게 일어난다는 것을 밝힐 수 있었다. 뿐만 아니라, AQ-seq을 이용하여 높은 비율로 유리딘화되는 마이크로RNA들을 동정할 수 있었는데, 모두 3p 가닥에서 유래한다는 점을 비추어 보았을 때 유리딘화 현상은 TUT4와 TUT7 단백질들에 의해 2차 전구체 단계에서 주로 일어난다는 점을 확인할 수 있다. 이러한 결과들을 통해 세포 내에서 마이크로RNA가 얼마나 복잡하게 구성되어 있는지 알 수 있고, 따라서 마이크로RNA 생합성의 대안적 경로에 대한 이해도를 높일 수 있다. 다음으로, 본 연구에서는 또 다른 대안적 경로인 가닥 변환에 관해 조사하였다. 가닥 선택 과정은 마이크로RNA 이중체의 두 가닥 중 어느 것이 최종적으로 기능하는지를 결정하는 매우 중요한 단계이다. 흥미롭게도, 세포 특성에 따라 선택되는 가닥이 크게 뒤바뀔 수 있는데 이를 ‘가닥 변환’이라 일컫는다. 가닥 변환은 해당 마이크로RNA 유전자의 기능을 완전히 바꿀 수 있지만 그것이 어떻게 조절되는지에 대해서는 알려져 있지 않다. 게다가 그것의 생리학적 의미도 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 가장 두드러지게 가닥 변환을 보이는 마이크로RNA 중 하나로 miR-324를 발견하였다. 뿐만 아니라 miR-324의 가닥 변환은 유리딘화 효소들인 TUT4와 TUT7이 조절한다는 것을 규명하였다. TUT4/7에 의해 miR-324의 2차 전구체가 유리딘화되면 다이서 효소의 절단 위치가 바뀌게 된다. 그 결과 만들어지는 마이크로RNA 이중체는 3p 가닥을 생성하는 반면, 유리딘화가 일어나지 않았을 때 만들어지는 이중체는 반대로 5p 가닥을 생성한다. 흥미롭게도, 교모세포종에서는 TUT4/7의 양이 증가한다는 것을 발견하였는데 그로 인해 miR-324의 3p 가닥 또한 증가한다는 것을 관찰하였다. 이를 응용하여, 역으로 miR-324의 5p 가닥을 늘리거나 3p 가닥을 억제하면 교모세포종의 세포 분열을 저해할 수 있었다. 따라서 본 연구는 가닥 변환 현상이 유리딘화에 의해 조절될 수 있다는 것을 밝혔고 이를 교모세포종의 진단 및 치료 목적으로 응용될 수 있음을 보여준다. 종합하면 본 연구는 대안적 경로에 의해 생성되는 마이크로RNA들을 보다 정확하게 발굴하였다. 이 결과를 통해 대안적 경로들이 세포 내에서 광범위하게 일어나면서 마이크로RNA들의 기능을 조절한다는 것을 알 수 있었다. 게다가 대안적 절단, 유리딘화 현상 뿐만 아니라 가닥 변환 또한 조절될 수 있는 현상임을 밝혔다. 따라서 본 연구는 대안적 과정에 의해 어떻게 마이크로RNA들이 정교하게 만들어지는지에 관해 그 분자적 기전과 중요성을 조명한다.MicroRNAs (miRNAs) modulate diverse biological and pathological processes via post-transcriptional gene silencing. The repertoire of functional miRNAs substantially varies depending on the cell types due to the regulations of miRNA biogenesis at the transcriptional and post-transcriptional levels. miRNA biogenesis involves serial maturation steps to produce single-stranded miRNAs from a hairpin-containing primary transcript. Notably, there are alternative pathways along the miRNA biogenesis, which lead to generation of multiple miRNAs from a single miRNA gene. Alternative miRNA biogenesis increases miRNA diversity and hence expands their regulatory capacity. Despite its profound effect on gene regulation, it is largely unknown which set of miRNAs undergoes alternative miRNA biogenesis and how alternative biogenesis is achieved. First, this study investigates two alternative pathways, alternative processing and 3′ end modification of miRNAs, which produce miRNA isoforms with varying 5′ and 3′ ends. Alteration of miRNA termini affects abundance and targeting capacity of miRNAs. High-throughput small RNA sequencing (sRNA-seq) has been widely adopted to detect miRNAs and their isoforms (isomiRs) de novo. However, the severe ligation bias inherent to conventional sRNA-seq methods hampers their accurate quantification and hence reliable profiling of the alternative pathways. I here developed an improved sRNA-seq protocol, termed AQ-seq (accurate quantification by sequencing), by utilizing adapters with terminal degenerate sequences and a high concentration of polyethylene glycol (PEG) which minimize the ligation bias during library preparation. Measurement using AQ-seq allows us to correct the previously misannotated 5′ end usage as well as strand preference in public databases. Importantly, the analysis of 5′ terminal heterogeneity reveals widespread alternative processing events which have been underestimated. It also identifies highly uridylated miRNAs originating from the 3p strands, indicating regulations mediated by terminal uridylyl transferases at the pre-miRNA stage. These results reveal the complexity of the miRNA isoform landscape, allowing us to refine miRNA annotation and to advance our understanding of miRNA biogenesis. Next, this study examines another alternative pathway, context-dependent strand selection of miRNAs. Strand selection is the last step of miRNA biogenesis, which determines the functional strand. Intriguingly, the dominant strand of some miRNAs changes depending on cellular contexts. However, the molecular mechanism and physiological significance of such alternative strand selection (or “arm switching”) remain elusive. Here, I find miR-324 to be one of the strongly regulated miRNAs by arm switching, and identify terminal uridylyl transferases TUT4 and TUT7 to be the key regulators. Uridylation of pre-miR-324 by TUT4/7 re-positions DICER on pre-miRNA and shifts the cleavage site. This alternative processing produces a duplex with a different terminus, from which the 3′ strand (3p) is selected instead of the 5′ strand (5p). In glioblastoma, the TUT4/7 and 3p levels are upregulated while the 5p level is reduced. Manipulation of the strand ratio is sufficient to impair glioblastoma cell proliferation. These results uncover a role of uridylation as a molecular switch in alternative strand selection and implicate its therapeutic potential. Taken together, this study unveils miRNAs that are generated by alternative miRNA biogenesis at a transcriptome-wide scale. Notably, my extensive investigation reveals that the alternative pathways are widespread and hence significantly affect the functionality of miRNAs. It also shows that not only alternative processing and 3′ modification but also arm switching can be a regulated cellular process. Therefore, this study sheds light on the mechanism and significance of alternative miRNA biogenesis.1 Introduction 1 1.1 MicroRNA, a class of small silencing RNAs 1 1.2 Metazoan microRNA biogenesis 2 1.3 Alternative microRNA biogenesis 5 1.3.1 Alternative processing by RNase III enzymes, DROSHA and DICER 5 1.3.2 Non-templated 3′ nucleotidyl addition by terminal uridylyl transferases, TUT4 and TUT7 7 1.3.3 Alternative strand selection (or “arm switching”) by AGO 9 2 Discovery of widespread alternative microRNA processing and 3′ end modification by bias-minimized small RNA-seq 11 2.1 Background 11 2.2 Results 14 2.2.1 Small RNA sequencing optimization using spike-ins 14 2.2.2 miRNA and isomiR profiles uncovered by AQ-seq 17 2.2.3 Re-assessment of strand preference 22 2.2.4 Correction of the 5′ end annotation 27 2.2.5 Widespread alternative processing 29 2.2.6 Highly uridylated miRNAs 31 2.3 Discussion 40 2.4 Methods 43 3 A mechanism for microRNA arm switching regulated by uridylation 51 3.1 Background 51 3.2 Results 54 3.2.1 Arm switching of miR-324 54 3.2.2 miR-324 arm switching is controlled by TUT4 and TUT7 58 3.2.3 Uridylation leads to alternative DICER processing of pre-miR-324 66 3.2.4 Alternative DICER processing is facilitated by the double-stranded RNA binding domain (dsRBD) 69 3.2.5 Alternative DICER processing leads to arm switching 75 3.2.6 Alteration of the miR-324 strand ratio affects cell cycle progression 77 3.3 Discussion 87 3.4 Methods 91 4 Conclusion 101 Summary (in Korean) 103 Bibliography 105박

한국인의 주거주기

이 글은 1977년도 필자의 전국의 주택유효수요추정연구를 위한 Survey에서 나온 자료를 토대로 하여서 작성되었다. 그 주된 목적은 우리나라 국민들의 생활주기와 자가소유과정을 중심으로 한 주거주기를 분석하는 것이다. 즉 주거주기라는 하나의 개념화의 시도와 이러한 개념을 통한 주거의 한 질적인 측면에 대한 사실적 연구(descriptive study) 이다. 따라서 이것은 주택정책수립시 고려되어야 할 주택의 질적인 측면에 관한 일고찰임을 지적하여 둔다.(단, 주택유효수요추정연구를 위한 Survey는 약일만 세대를 대도시, 중소도시, 산업도시, 농어촌으로 층화하여 4 : 4 : 1 : 1의 비율로 추출한 표본이었다. 따라서 여기에 나와있는 각종 비율은 그것이 그대로 대표치가 아님을 밝혀둔다.

정책문제연구를 위한 조사설계

정책문제를 해결하는데 있어서 조사방법을 많이 활용하는데, 이때 조사를 통하여 주어진 목적을 효과적으로 달성하기 위해서는 먼저 조사설계가 과학적으로 이루어져야 한다. 조사설계란 어떠한 실제상황이 일어나기 전에 그러한 상황 속에서 어떠한 행동을 할 것인가를 결정하는 과정 즉, 조사문제에 대한 계획이라고 할 수 있다. 그러므로 조사설계의 과학성여부가 조사활동전반에 결정적인 영향을 미칠 수 있다. 왜냐하면 조사활동의 목적이나 내용이 아무리 훌륭하다 하더라도 조사활동자체가 자의적이고 반복실험될 수 없는 것이라면 조사설계는 신뢰성이 떨어지게 마련이기 때문이다. 이런 점에서 조사설계는 조사연구의 자기통제적인 기능을 제공해 주어 조사연구의 정당성을 제고시켜 준다. 이글은 이와 같은 이해하에서 조사설계의 성격, 조사연구의 정당화, 연구문제의 연역적 고찰, 개념틀 만들기, 조사목표의 진술을 살펴보았다

각국의 부패통제 -법과 기구-

우리나라의 경우 최근 들어와서 공직자와 관련된 각종 비리·부정부패가 나타나고 있으나, 이들을 억제 내지는 통제할 수 있는 제도적 수단은 극히 미비한 실정이다. 물론 이러한 제도들만 갖추어져 있다고 해서 부패가 통제되는 것은 아니다. 즉 정치발전의 선행 등 많은 외적 조건의 충족하에서만 적절히 운영될 수 있다. 본고에서는 이러한 취지에서 동남아 각국 즉 대만, 싱가포르, 자유중국 등의 관료부패통제제도들을 고찰하고, 미국, 서독 등 선진국의 직무감찰기구를 고찰하였다. 이러한 외국의 예를 통해서 우리나라의 경우에도 부패통제를 위한 상설기구나 법을 만드는데 어느 정도 시사점을 얻을 수 있을 것이다.이 연구는 1991년도 서울대학교 대학발전기금의 연구비 지원에 의하여 이루어졌음

사회과학에 있어서의 측정과 이에 수반되는 몇가지 문제점

아주 넓은 의미에서는 측정이란 어떤 사실을 묘사 또는 기술하는 방법의 하나라고 말할 수 있다. 과학은 이 우주의 여러가지 사실을 묘사하는 작업으로 부터 시작한다. 측정 지역의 인구가 얼마나 되고 가구수가 얼마나 되고 그들의 직업은 무엇이며, 수입은 얼마나 되는지 그리고 직업이외의 어떠한 중요한 활동들을 하고 있는지, 그리고 그들은 그들의 직업이나 생활에 만족하고 있는지 어떠한 면이 덜 만족스러운 것인지, 또한 어떠한 사건이나 행사, 또는 제도에 대한 사람들의 반응은 일반적으로 어떠한 것이며 그 이유는 무엇인지 등에 관하여 기술하고 이것을 어떠한 의미체계내에서 분류하고, 이와같이 분류된 각 카테고리의 크기나 제도를 묘사하고 또한 어떠한 사상의 기능이나 성질 나아가서 어떠한 사실과 어떠한 사실 또는 어떠한 속성과 속성간의 관계가 어떠한 것인지 밝혀서 묘사한다. 이러한 묘사의 범위는 극히 미세할 수도 있고 무한히 클수도 있다. 문제는 그 범위가 어떠든 간에 그 묘사의 방법이 얼마나 적절한가가 중요한 것이다. 이러한 묘사방법의 적절성은 물론, 그것을 묘사하는 또는 조사하는 목적에 달려있다. 어떠한 관광지에 관광객을 유치하기 위한 선전이 목적인 경우 그 산수의 수려함을 수자에 의하여 묘사한다든가 사랑하는 여인에게 자기의 심정을 수자로 묘사하는것 보다는 전자는 그 풍경을 그린 그림이나 사진으로 후자는 편지로 묘사하는 것이 보다더 효과적일 것이다

부패와 작용

여기서는 부패의 개념규정을 시도하고, 부패를 조성하는 여러 가지 조건들을 살펴보았다. 그리고 부패 통제시 고안되어야 할 점들은 그것의 역기능적 측면과 그리고 부패가 상당히 진행되고 있는 사회에서의 부패의 작용에 대하여 살펴본다

최근 청년층 실업 문제와 인적자원개발 방향(Youth unemployment and policy of human resource development in Korea)

The IMF crisis which started late in 1997 caused massive unemployment in Korea. The crisis placed a high toll on young workers, especially on those at age between 25 and 29. However, even after the crisis, the high unemployment rate of young workers persisted. This study addresses the issue of high unemployment of younf workers in Kora. It argues that the Human capital theory(Becker, 1975) and Institutional Theory(Coase, 1965North, 1996) based on the Neo-classical economic perspective can offer only limited explanations on the unemployment of young workers in Korea. But, the New institutionalism Analysis(Granovetter, 1985Kim Hae-dong, 1995) perpective which focuses on the socio-cultural and institutional aspects provides a better explanation for high unemployment of young workers in Korea. The recently observed high unemployment of young workers is not a cyclical unemployment, which should wither away if the economy picks up. But, it is a long-trem phenomenon, which should be systematically dealt with. As a solution to deal with the current high unemployment of young workers, the study suggests improvement of the current vocational education and training system. Improving the current vocational education and training system for the young workers is very important in this knowledge based-economy. In particular, we need to improve the according to their skill levels and updated education and training according to the technological changesso that young workers can choose education and training programs according to their skill levels, starting from education and training programs for low-level skilled workers and moving to those for highly skilled workers

가설 구성과 이에 관련된 몇가지 문제점

조사문제를 형성함에 있어서 중요한 배려사항의 하나는 그 문제가 시험에 가능하도록(testable)형성되어야 함은 여러곳에서 지적한바와 같거니와 이말은 결국 경험적으로 그것의 사실여부를 확인할 수 있거나 그것의 개연성의 정도(degree of probalility)를 제시할수 있도록 되어 있어야 한다는 것이다. 또한 그것의 타당성여부나 개연성의 정도를 제시한다는 말은 그 문제에 대한 대답이나 해결을 얻을 수 있는 근거를 얻을 수 있다는 뜻이 되기도 한다. 그러기 위하여는 우선 그 문제에 대한 정책이라고 생각되는 바의 것을 제시할 것은 과학적방법은 요구한다. 그리하여 정책이라고 생각되는 바의 것을 시험(test)하여 보아서 그것의 타당성이 확인되면은 정책이라고 생각되는 바의 것이 그 문제에 대한 정책이 되는 것이다. 그러나 이러한 정책이라고 생각되는 바의 것이 시험의 결과 반드시 타당한 것으로 판단될 보장은 물론없다. 이러한 과학적 방법의 절차는 그 근본적으로는 다분히 시행착오적인 일면이 있음을 보여주는 것이라고 할수 있다. 따라서 조사자는 그의 지식과 경험을 총동원하여 가장 정책에 가깝다고 생각되는 바의 것이 제시되도록 하여야 함은 말할 나위도 없다. 물론 이때 그러한 정책(잠정적)은 그것의 타당성여부를 가릴수 있도록 구성되어야 한다. 그러한 까닭에 조사문제를 형성한다는 말에는 이러한 잠정적 정책까지를 포함한다고 말할수 있다