자유롭게 움직이는 생쥐의 해마에서 sharp wave-ripple의 전기생리학적 신호와 칼슘 신호를 동시에 기록하는 방법과 활용

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의과학과, 2023. 2. 김상정.Various experiences occur in our daily life in diverse context, and among them, some experiences become a life-long memory while some are easily forgotten. Not only encoding of experiences, this phenomenon of memory selection is heavily dependent on the consolidation of memory. In the investigation of long-term memory formation, hippocampal SWR signal and its neuronal contents have been extensively studied using neuronal decoding analysis of electrophysiological signal to recognize SWRs in the neuronal signals. However, as this signal has low spatial resolution and hard to track neurons across time, it has been difficult to analyze the individual contribution of neurons to task-specific SWRs. In this work, I focused on the investigation of the hippocampal SWRs in spatial aspect not only in temporal aspect, and identification of cellular ensembles consisting of the activity to improve contents of consolidated memory by SWRs. To understand the composition of SWRs and its change by the environment in detail, I divided the research process into two parts. In the first part, to investigate individual hippocampal neuronal activity participating in SWRs activity, I developed a Microdrive array with tetrodes, that combines with UCLA miniscope, a 1-p calcium imaging device. This method enables us to observe SWRs activity not only populational electrophysiological manner, as well as individual cellular activity using calcium indicators from freely behaving animals. The acquired data show that a group of hippocampal neurons was identified to have increased activity on the onset of SWRs, while activities were found to be decreased when SWRs are disrupted. This result implies the potential contribution of individual neuronal activity in the memory consolidation process. In the second part, the calcium transient signals acquired from hippocampal neurons was compared by the environment of the animal. While animals are exploring two different environments, SWRs were detected in real-time and hippocampal neuronal activities were observed simultaneously. From the result, we found that different subsets of neurons are firing during SWRs depending on the environment of the animals, suggesting that SWR signals are collective signals of multiple neurons but their compositions are different by the contents of experience. This result has a potential to improve decoding accuracy when investigating replay contents and neuronal composition. Overall, this thesis covers comprehensive strides from the development of tools to analysis of scientific findings in search of neuronal constitution of memory engraved in the hippocampus.우리의 일상 생활에서는 다양한 경험이 다양한 환경에서 일어난다. 그 중 일부는 평생 지속되는 강렬한 경험이 되기도 하고, 다른 경험들은 기억도 되지 못하고 쉽게 잊혀진다. 이러한 기억의 선택적 저장에는, 경험의 입력 과정(encoding) 뿐 만 아니라 경험의 강화 (consolidation) 과정도 큰 영향을 끼친다. 해마의 sharp wave-ripples (SWRs) 와 그 구성 뉴런들은 장기 기억의 형성 과정을 연구하는 데에 큰 비중을 차지해왔다. 특히 이 뉴런의 신호들은 전기생리학적 방식으로 기록되고 연구되었다. 그러나, 이러한 신호들은 뉴런의 위치에 대한 정보가 부족하고 장기간에 걸쳐 같은 뉴런을 인식할 수 없기 때문에, 특정 환경에서 일어나는 SWRs이 어떠한 뉴런으로 구성되어있는지 연구하는 데에는 어려움이 있었다. 이 논문에서는, 해마의 SWRs을 구성하는 뉴런들을 시간적 측면 뿐 만 아니라 공간적 측면에서도 관찰하여, SWRs로 인해 강화되는 기억을 구성하는 뉴런들을 식별하고자 하였다. SWRs의 구성과 환경에 따른 구성의 변화를 알아보기 위해, 본 연구는 아래의 두 부분으로 나누어 진행되었다. 첫번째 부분에서는 전기생리학적 방법과 칼슘 이미징 방법을 통해, 자유롭게 움직이는 생쥐의 해마에서 발생하는 SWRs을 두 가지 방법으로 기록하고, 그 신호에 따라 변화하는 뇌세포의 활동을 알아보고자 한다. 이를 위하여 살아있는 동물에서 실시간으로 전기신호를 측정할 수 있는 초소형 기구를 만들고, 이를 단광자 칼슘 이미징 장치와 결합시켰다. 이러한 방식을 통해 해마의 SWRs을 전기생리학적 방식과 칼슘 신호의 두 가지 방식으로 기록하였다. 기록 결과, 해마의 뇌세포들의 활동성이 SWRs이 시작됨에 따라 증가하는 것이 확인되었다. 반면, SWRs이 방해된 경우에는 해마 뇌세포의 활동성 증가가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, SWRs을 구성하는 세포들이 기억 강화 과정에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 두 번째 부분에서는, 해마 뉴런에서 얻어진 칼슘 신호들을 동물들의 실험 환경에 따라 비교하여 보았다. 동물들이 두 개의 다른 환경을 경험하고 있는 동안, 해마에서 발생하는 SWRs 신호가 실시간으로 기록되었다. 그 결과, 동물들이 처한 환경에 따라서, 서로 다른 해마 뉴런으로 구성된 그룹들이 SWRs을 구성하고 있다는 것을 발견하였다. 즉, 해마의 SWRs들은 여러 뉴런의 신호들로 이루어져 있으나 그 각각을 구성하는 뉴런은 경험의 환경에 따라 달라질 수 있음을 보여준다. 또한 이러한 결과는, 기억의 재생 (replay)과 그 구성 뉴런을 식별하기 위한 신호의 해독(decoding) 과정에서의 정확성을 높이는 데에 기여할 수 있음을 보여준다. 정리하면, 이 논문을 통하여, 해마에 저장되어 있는 기억을 구성하는 뉴런들을 식별하기 위한 실험 도구의 개발부터 그 결과 발견한 과학적인 내용의 분석에 이르기까지의 단계들을 포괄적으로 기술하고 소개하고자 한다.Abstract 4 Table of contents 7 List of figures and tables 8 Chapter 1. Introduction 10 Chapter 2. Simultaneous cellular imaging, electrical recording and stimulation of hippocampal activity in freely behaving mice 39 Summary 39 Introduction 41 Materials and Methods 43 Results 53 Discussion 58 Chapter 3. Simultaneous cellular imaging and electrical recording for dissecting neuronal ensemble activity of SWRs in multiple environments 76 Summary 76 Introduction 77 Materials and Methods 78 Results 79 Discussion 81 Chapter 4. Conclusion and future perspective 88 References 92 국문요약 113박

형식적 증명에 대한 수준별 지도 방안 연구

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 수학교육과, 2017. 2. 김서령.수준별 수업은 학생의 능력과 특성을 고려한 수업 방법 중 하나이다. 따라서 수준별 수업은 학습 내용 특성, 학생의 인지 수준 등을 고려하여 유연하게 적용하여야 한다. 그러나 지금까지의 우리나라 수준별 수업은 학급으로 구분하여 적어도 두세 달 동안은 고정적으로 유지되어 운영되어 왔다. 실제로 이러한 수준별 수업의 효과에 있어서 긍정적인 연구결과도 있지만 부정적인 연구결과 역시 많이 있다. 본 연구는, 수준별 수업이 필요한 상황과 방법에 대한 분석이 필요하다는 문제의식으로부터 출발하였다. 교과내용에 따라 필요한 경우에만 수준별 수업을 실시할 수 있고 학생들의 의견을 존중하여 집단을 나눌 수 있다는 점에서, 학급 내 수준별 수업이 기존 수준별 수업의 단점을 보완하고 그 취지를 살릴 수 있다는 가설을 설정하였다. 이 가설을 검증하기 위하여 형식적 증명을 다루고 있는 근의 공식을 수준별 수업의 주제로 택하여 실험을 하였다. 수학적 증명은 몇 가지 구체적인 상황을 관찰하여 추측하는 것이 아니라 수학적 추론을 통해 가정을 만족하는 모든 경우에 명제가 성립함을 보이는 것이기 때문에 일반화를 할 수 있는 사고 능력이 중요하다. 특히 형식적 증명은 추론과정에서 일반화를 할 뿐만 아니라 표현에 있어서도 문자와 같이 일반성을 내포하는 언어를 사용한다. 기존의 증명 수준 이론들에 따르면 각각의 사례를 관찰하는 수준과 사례를 통해 일반성을 인식할 수 있는 수준, 그리고 형식적 증명을 할 수 있는 수준을 서로 구분할 수 있으며, 적절한 교수가 없이는 낮은 수준에 있는 학생이 더 높은 수준의 증명을 이해하기 어렵다. 따라서 학생의 일반화 능력에 따라 근의 공식 유도를 차별화하여 지도해야할 필요가 있다. 본 연구는 먼저, 증명 수준 이론을 토대로 학습지를 세 수준으로 구분하여 제작하고 예비 실험을 실시하였으며, 그 결과를 바탕으로 학습지를 보완하여 본 수업 실험을 실시하였다. 본 수업 실험에서 학생들은 자신의 선행 학습내용 이해 정도와 문자 이해 수준을 바탕으로 스스로 학습지를 선택하였고, 같은 학습지를 선택한 학생들끼리 모여 근의 공식 유도 내용을 학습하였다. 실험 결과 학생들은 학습지 활동에 적극적으로 참여하였으며, 수업 후에는 각자의 표현을 사용하여 근의 공식의 의미를 설명할 수 있었다. 또한 교사는 수준별 학습지 활동 시간에 도움이 필요한 학생에게 좀 더 집중하여 지도할 수 있었다. 추가적인 인터뷰를 통해 학생들이 자신의 수준에 맞는 학습지 활동에 만족함을 확인할 수 있었다.Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 이론적 배경 3 2.1 수준별 수업 3 2.1.1 수준별 수업의 효과에 대한 선행연구 3 2.1.2 수준별 수업의 유형과 특징 7 2.1.3 개별화 수업으로서의 수준별 수업 9 2.2 형식적 증명 11 2.2.1 증명 수준 이론 13 2.2.2 문자 이해 수준 19 Ⅲ. 형식적 증명의 수준별 지도 25 3.1 형식적 증명의 수준별 지도의 필요성 25 3.2 형식적 증명의 수준별 수업의 실제 26 3.2.1 단원 선정 26 3.2.2 학습자의 준비도에 따른 수업 설계 28 3.2.3 수업 결과 및 논의 33 Ⅳ. 요약 및 결론 42 참고문헌 47Maste

한국 상위 영어 학습자들의 영어 설득문에 나타난 오류와 작문 능력의 관계

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :외국어교육과 영어전공,1998.Maste

Molecular cloning of 5-3-ketosteroid isomerase from pseudomonas putida biotype B

Maste

The role of post translational modification on the pathogenesis of Alzheimer's disease

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 의학과 생화학 전공, 2013. 2. 묵인희.서론: Alzheimers disease (AD)의 특징으로는 Aβ의 축적과 tau의 과인산화 (hyperphosphorylation)가 있으며, 병인기전의 원인으로는 glucose metabolism과 axonal transport의 저해 등을 들 수 있다. Glucose metabolism의 저해는 결국 세포내의 O-GlcNAc을 낮추어 tau의 과인산화를 일으키고, Aβ는 GSK3β관련 신호전달을 통해 HDAC6의 활성을 높여 세포내의 acetylation을 낮추어 axonal transport를 저해한다. 단백질의 활성은 인산화, acetylation, O-GlcNAc등의 다양한 번역 후 수식화 (post-translation modificationPTM)에 의해 조절 되며, AD에서는 PTM의 조절이 망가져 있어서 단백질의 기능이 정상인에 비해 높거나 저해되어 있다. 본 연구에서는 AD에서 낮아져 있는 세포내의 O-GlcNAc과 acetylation을 증가시켜 준 후, O-GlcNAc관련해서는 Aβ의 생성에 어떠한 효과를 주는지를 확인 하였으며, acetylation 관련해서는 미토콘드리아의 axonal transport에 어떻게 영향을 주는 지를 규명하였다. 방법: (1) O-GlcNAc을 증가시키기 위해서 O-GlcNAcase 저해제인 NButGT를 이용하였으며, AD 병인기전에서의 효과를 확인하기 위해서는 AD 동물모델 인 5XFAD mice를 사용하여, 5XFAD mice에 NButGT를 복강내 주사하여 Aβ의 축적과 Aβ에 의한 증상들의 변화를 확인하였다. (2) α-tubulin의 acetylation을 증가시키기 위해서는 HADC6의 저해제인 Tubastatin A (TBA)를 사용하였으며, primary hippocampal neuron에 Aβ와 TBA를 처리하여, 미토콘드리아의 axonal transport를 microfluidic chamber system에서 관찰하였다. 결과: (1) NButGT를 주사한 5XFAD mice는 주사하지 않은 5XFAD mice 와 비교하였을 때, Aβ의 축적과 생성이 감소하였으며, 신경 염증 (neuroinflammation)과 기억력 저하 (memory impairment)가 회복 되었다. 이것은 감마 시크리테아제의 구성 단백질 중에 하나인 NCT의 Ser 708에 O-GlcNAc 결합이 증가함에 따른 것으로, NButGT에 의해 NCT의 O-GlcNAc이 증가함에 따라 감마시크리테아제의 활성이 낮아졌다. (2) 5XFAD mice의 뇌 조직에서 α-tubulin의 acetylation의 정도를 확인한 결과 낮아져 있었다. Aβ로 인해 미토콘드리아의 axonal transport는 anterograde와 retrograde 양방향에서 모두 저해되는데, 이때 TBA를 처리하게 되면 Aβ에 의해 감소된 미토콘드리아의 속도와 운동성 모두 회복 되었다. 또한 Aβ에 의해 짧아진 미토콘드리아의 길이도 TBA에 의해 회복되는 것을 확인하였다. 결론: AD에서 감소되어 있던 단백질의 PTM을 각각의 저해제를 이용하여 조절 한 결과 AD의 병인기전으로 알려진 Aβ의 축적, 기억력 저하, 신경 염증의 증가 등이 호전되었고, 미토콘드리아의 axonal transport의 저하도 회복 되었다. 따라서 단백질의 PTM을 조절하는 것이 AD 병인기전을 치료하는데 하나의 치료 표적이 될 수 있을 것이라 생각된다.초 록 i 목 차 v 표 및 그림 목록 vi 서 론 1 실험 재료 및 방법 12 결 과 27 고 찰 62 결 론 75 참 고 문 헌 76 초 록 (영 문) 91Docto

A Study on the Establishment of Busan Port-Based Fulfillment Center for E-Commerce between Countries

전자상거래 기반의 온라인 시장은 국경을 초월한 장벽이 무의미해지면서 성장세를 이어가고 있다. 특히 국내 온라인 직접•역직구액은 2014년 7000억 원에서 2019년 6조5000억 원으로 증가하였고 2014년부터 2019년 사이 연간 55%의 성장률을 보이고 있어 국내외 전자상거래 업체들은 교통•보관 등 물류비 절감을 실현할 수 있다. 아시아 전자 상거래의 수요에 대응해, 풀필먼트 서비스의 물류 경쟁력을 확보하기 위해서는, 물류 센터를 고려할 필요가 있다. IT기반 상거래 시장은 COVID-19와 함께 많은 변화를 겪었다. 사회적 거리와 이동제한 추세로 오프라인 거래가 온라인 거래로 전환되고 오프라인이었던 생필품이 확대 강화될 가능성이 높다. 물류센터를 운영하는 물류회사들도 화물처리와 화물처리의 전통적인 물류기능 변화에 위협을 받고 있다. 전자상거래를 기반으로 상업항 건설 여부에 대한 연구를 진행하기 위해 전자상거래의 환경 변화와 전자상거래 시장의 규모 전망을 조사했다. 이 밖에도 전자 상거래항의 개념과 국내외의 항만 단지의 활용도, 국내의 특수 선박 기지(인천•평택•부산)에 대한 조사도 행해졌다. 이번 조사 분석을 바탕으로 상업항 이용 수요와 전자상거래 기반의 이용 품목을 통해 실현센터를 구축할 필요가 있다. 우선 전자상거래 기반의 글로벌 시장이 거대한 온라인 시장으로 전환돼 국가 간 무역장벽을 해소하고 COVID-19의 영향과 함께 폭발적인 성장을 경험하고 있다. 두 번째로, 전자 상거래를 위한 수출입 품목의 필요성이 다양화해, 소형•경량품을 중심으로 한 항공 운송에 대해, 대형•중형품•중량물의 해상 수송의 필요성이 부상했다. 세 번째로, Amazon, 알리바바 등 글로벌 온라인 기업은, 유통으로부터 물류 서비스에 이르기까지, 영토 파괴에 의한 풀필먼트센터 서비스를 급속히 확대하고 있다. 넷째, 산호 뒤에 위치한 물류단지의 전통적인 기능뿐 아니라 변화하는 추세에 발맞춰 미래를 대비하는 내실 있는 센터를 구축할 필요가 있다.제1장 서론 1 제1절 연구의 배경 및 목적 1 제2절 연구의 방법 및 구성 3 제2장 이론적 배경 5 제1절 국가간 전자상거래의 개요 및 현황 5 1. 국가간 전자상거래 개요 5 2. 글로벌 전자상거래 시장규모 7 3. 국내 국가간 전자상거래 시장 및 실태 8 4. 전자상거래기반 물류프로세스 14 제2절 국가간 전자상거래의 항만/해운 활용방안 17 1. 변화된 항만의 역할과 기능 17 2. 전자상거래 상업항 21 제3장 국내 주요항만의 전자상거래 기반 현황분석 24 제1절 항만배후부지 이용 현황 24 1. 인천항 항만배후단지 24 2. 평택항 항만배후단지 24 3. 광양항 항만배후단지 25 4. 부산항 항만배후단지 25 5. 전자상거래 기업의 국내 항만 이용 시사점 28 제2절 전자상거래 기반 해상특송장 현황 31 1. 한국의 국제 전자상거래 통관제도 31 2. 인천 해상특송장 32 3. 평택 해상특송장 32 4. 부산 해상특송장 33 제4장 실증분석 35 제1절 조사개요 35 제2절 해상운송 전환수요 분석 37 제3절 설문조사를 통한 전환수요 추정 39 1. 설문 조사결과 40 2. 전환수요 43 제5장 결론 46 제1절 연구결과 요약 46 제2절 연구의 한계점 및 향후 과제 47 참고문헌 48Maste

Pd-catalyzed asymmetric hydroalkoxylation of tertiary alcohol

MasterMono- and oligosaccharides, containing tertiary alcohol at anomeric center, are core moieties of many naturally-occurring compounds exhibiting biological activity as antitumor agents. The synthesis of these oligosaccharides through classical glycosylation method has been a difficult task because of steric bulk arising from tertiary moiety and hence not a suitable candidates as glycosyl acceptors. Moreover, the stereoselective synthesis of β-anomer is thermodynamically unfavorable because of inherent preference for α-anomer due to anomeric effect. Therefore, the development of an efficient stereoselective synthetic route of oligosaccharides containing tertiary alcohol at anomeric position is important. In this thesis, we have demonstrated a novel stereoselective method to synthesize these sugars having tertiary alcohol at anomeric position by using strong base with the previously optimized palladium-catalyzed hydroalkoxylation conditions developed by Rhee’s group. Surprisingly, we observed the inversion of anomeric stereocenter of newly formed O,O-acetal bond, which is in contrast to results reported by Rhee’s group. Our initial goal is to synthesize Amicenomycin B, an antibiotic and antimicrobial agent, containing a trisaccharide attached via β-linked tertiary alcohol. Despite a number of useful biological applications, there are no reports on the synthesis of Amicenomycin B. The model studies towards the synthesis of Amicenomycin B is demonstrated in this thesis. We anticipate that this new protocol will inspire future endeavors in synthesizing and finding new bioactive oligosaccharides that contain tertiary alcohol at the anomeric center

B형 간염 치료용 DNA 백신 (HB-110)의 전임상 연구

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 생물화학공학전공, 2014. 8. 김병기l.현재까지 개발되어 사용되고 있는 Hepatitis B virus (HBV) 치료제들은 면역치료제인 Interferon-α및 화학요법제인 Lamivudine, Adefovir, Entecarvir 등이 있다. Interferon-α 경우 투여시 부작용이 심하며, 화학요법제들은 바이러스 증식억제의 장점을 가지고 있으나, 환자에 장기간 투여시 독성, 내성바이러스 출현이 발생되며, 투여 중단시 HBV의 recurrence가 발생되는 제한이 있다. 본 연구에서는 현재 사용하는 치료제보다 유효성 및 안전성이 우수한 HBV 치료제를 개발하기 위해HBV 감염자 대상으로 치료 DNA 백신 개발을 진행하고 있으며, 먼저 선도 물질인 HB-100을 개발하여 우크라이나 및 리투아니아에서 사전임상을 실시하여 안전성 및 유효성을 확인하였다. 그리고 HB-100보다 효능이 우수하며 경제적으로 생산이 가능한 HB-110을 개발하였다. 본 연구에서는 HB-110의 생산공정을 확립하였으며, 물리화학 및 생물학적 특성분석과 안정성, 독성, 역동력학 연구를 수행하여 전임상 연구를 완료하였다. HB-110은 HBV 항원유전자 및 변이체 IL-12 유전자를 발현하는 3종의 naked plasmid로 이루어진 DNA 백신으로, E. coli DH5에 각각의 plasmid를 형질전환시켜 생산세포주 bank를 제조하였다. 제조된 세포주 bank를 대상으로 세포주의 유전형, 표현형 및 오염여부 등에 대해 시험을 수행하였으며, 적합하게 제조된 것을 확인하였다. 제조된 세포주를 이용하여 생산공정을 확립하였으며, 배양공정에서 배양중 glycerol 첨가와 정제공정단계에 thiophilic/aromatic adsorption 크로마토그래피를 실시하여 supercoiled monomer 형태가 90% 이상 순도의 plasmid 시료를 확보 할 수 있었다. 확립된 생산공정을 이용하여 생산된 HB-110에 대해 유전자 치료제의 가이드를 적용하여 물리화학 및 생물학적 특성분석을 진행하였으며, 이를 기반으로 생산된 HB-110이 의약품으로 사용 적합성을 판단하는 품질기준 시험법을 수립하였다. 독성시험은 확립된 생산공정으로 생산한 HB-110을 대상으로 안전성 평가연구원 및 Ina(일본)에서 설치류 및 원숭이에서 평가를 실시하여, HB-110이 안전한 물질임을 (NOAEL ≥ 4mg/kg) 확인하였다. 약동력학 연구는 마우스에서 실시하였으며, 정맥으로 투여 후 평가결과 half-life가 1.9분이며 AUC가 103 ug min/ml로 나타났다. 투여 경로인 근육내 투여시 근육내에서 약 11일까지 HB-110이 잔류되는 개체가 존재하였으며, 타장기에서는 투여 후 8시간 이후에는 검출한계(0.01pg/mg tissue) 미만으로 나타났다. 이렇게 확보된 전임상 자료를 이용하여 제1상임상 시험계획서(IND)를 KFDA에 제출하여 승인을 득하였으며, 카톡릭의대 강남성모병원에서 HBV 감염자 대상으로 1상임상을 완료하였다. 또한 본 연구에서는 HB-110의 효능을 향상시키기 위해 전기천공법(electroporation) 적용연구를 실시하여, S항원 유전자의 발현을 대폭적으로 증가시켰으며, 세포성 면역반응이 항원에 따라 약 1.7∼3배 이상 향상되는 것을 mouse 시험을 통해 확인하였다. 향후 2상 임상시험에서는 전기천공법을 적용할 계획이며, HB-110의 효능증가를 기대 할 수 있을 것으로 예측된다.Interferon-a immunotherapy and chemotherapeutic agents including Lamivudine, Adefovir and Entecarvir have been developed so far for the treatment of Hepatitis B Virus (HBV) infection and are widely used. Interferon-a is associated with serious side effects, while chemotherapeutic agents, although being generally safe and effective at inhibiting virus proliferation, also show toxicities after long-term use. Importantly, chronic administration of chemotherapeutic agents is often associated with occurrence of resistant virus in patients. Also, recurrence of HBV is common once these agents are discontinued. With the purpose of providing an HBV therapy with efficacy and safety superior to existing therapies, in the present study a therapeutic DNA vaccine was developed for the treatment of patients with HBV infection. Safety and efficacy of the lead compound, HB-100, was demonstrated in a pilot clinical study conducted in Ukraine and Lithuania. Later, an optimized compound, HB-110, with higher efficacy and economic productivity compared to HB-100 was developed. A production process for HB-110 was developed, and preclinical studies were conducted including physicochemical/biological characterization, stability, toxicity and pharmacokinetics (PK). HB-110 is a DNA vaccine comprised of 3 different naked plasmid vectors, which express HBV antigens and a mutant IL-12. Escherichia. coli DH5a cells were transfected with the plasmids to produce production cell lines for each plasmid. Production cell banks of each cell line were established and characterized for genotype, phenotype and adventitious contamination. Production processes using the cell lines were established for each plasmid, and plasmid material with purity higher than 90% supercoiled monomer could be obtained by a combination of a glycerol-based feeding strategy during the culture process and incorporation of TAA chromatography in the purification process. In accordance with regulatory guidelines for gene therapy products, physicochemical and biological characterizations were performed for HB-110 produced using the established production process, and quality test methods were established for the quality control and release testing of clinical-grade material. Toxicity evaluation of HB-110, conducted in rats and monkeys at KIT (Korea) and Ina (Japan), demonstrated that HB-110 was safe, with a NOAEL ≥ 4 mg/kg. A PK study conducted in a mouse model showed a half-life of 1.9 minutes and AUC of 103 ug min/ml after IV administration. Residual HB-110 was detected in the muscle at the site of administration until approximately 11 days after IM administration, whereas in other organs HB-110 levels fell below the limit of detection (0.01 pg/mg tissue) after 8 hours post-administration. Based on the data obtained from the preclinical studies, an investigational new drug application (IND) was submitted to and approved by the KFDA, and a phase 1 clinical study involving subjects with HBV infection was conducted and completed at The Catholic University of Korea Seoul St. Mary’s Hospital. With the purpose of further enhancing the efficacy of HB-110, electroporation studies in mice were conducted which showed a sharp increase of S antigen gene expression and enhancement of cellular immune response by a factor of about 1.7 to 3 times depending on the antigen. The electroporation method is planned to be incorporated in future phase 2 clinical study protocols to further enhance the clinical efficacy of HB-110.ABSTRACTS ............................................................................................................... i CONTENTS .................................................................................................................iii LIST OF TABLES .....................................................................................................viii LIST OF FIGURES......................................................................................................x LIST OF ABBREVIATIONS................................................................................... xiii I. INTRODUCTION……………………………………………………………1 1.1 Hepatitis B Virus……………………………………………………………1 1.1.1 HBV Structure………………………………………………………….1 1.1.2 Life cycle……………………………………………………………….3 1.1.3 Transmission……………………………………………………………3 1.1.4 Epidemiology…………………………………………………………...4 1.1.5 Disease progression……………………………………………………..7 1.2 Therapeutic DNA Vaccine ...………………………………………………...7 1.2.1 Why is Therapeutic DNA Vaccine Needed ?.……………………... …….7 1.2.2 Possibility for the Development of Therapeutic Vaccine……………........9 1.2.3 Antigen Gene Selection ……………………………………………….11 1.3 Current Development Status of Therapeutic Vaccine ....……………………12 1.4 Preliminary Study: HB-100 (Lead) Study………………………………......12 1.5 Selection and Development System of Therapeutic DNA Vaccine Candidate (HB-110)……………………………………………………………………16 1.5.1 Candidate (HB-110) Selection…………………………………………16 1.5.2 Development System………………………………………………….20 II. MATERIALS AND METHODS .....................................................................22 2.1 Establishment of the Production Process for HB-110 Sample ……….……22 2.1.1 Selection of Host Cell and Cell Line Manufacturing…………………22 2.1.2 Fermentation Process ………………………………………………..23 2.1.3 Purification Process………………………………………………….23 2. 2 CMC (chemistry, manufacturing & control) Study………………………....24 2.2.1 Physicochemical Characterization……………………………………24 2.2.2 Biological Characterization…………………………………………..24 2. 3 Specifications and Test Procedures………………………………………...25 2.3.1 Quality Control Items and Specifications for Plasmid DNA…………..25 2.3.2 Establishment and Validation of HBcAg Quantification………………25 2.3.3 Identification of the Expression of L and Polymerase Proteins. ………25 2.4 Selection of Dosage Form and Stability Test……………………………….26 2.4.1 Dosage Form Design and Long-term Test……………………………26 2.5 Safety Evaluation…………………………………………………………..29 2.5.1 HB-110 Sample Production for Safety Evaluation……………………29 2.5.2 Safety Assessment in Small Animals…………………………………29 2.5.2.1 Acute Toxicity Test for Single Intramuscular Injection in Rats……30 2.5.2.2 Acute Toxicity Test for Single Intravenous Injection in Rats ……..30 2.5.2.3 26-Week Chronic Toxicity Test for intravenous Injection in Rats…30 2.5.2.4 Genetic and Reproductive Toxicity Test for HB-110 in Rats...……30 2.4.2.5 Immunotoxicity Test for HB-110 in Mice……………………..…30 2.4.3 Safety Evaluation in Monkeys……………………………………30 2.6 Pharmacokinetic Study……………………………………………………31 2.6.1 HB-110 Preparation…………………………………………………31 2.6.2 Intravenous Administration of HB-110………………………………31 2.6.3 Intramuscular Administration of HB-110…………………………….33 2.6.4 Analysis of HB-110 in Blood Samples by Polymerase Chain Reaction (PCR) ………………………………………………………………..33 2.6.5 Analysis of HB-110 in Tissue Samples by Polymerase Chain Reaction (PCR) ………………………………………………………………..34 2.6.6 Evaluation of Biodistribution using RT-PCR…………………………34 2.7 HB-110 Manufacturing for Phase 1 Clinical Trial………………………….35 2.8 Phase 1 Clinical Trial on HB-110…………………………………………..35 2.9 Efficacy Enhancement Study………………………………………………35 2.9.1 HB-110 Preparation………………………………………………….37 2.9.2 Experimental Animals and Immunization ……………………………37 2.9.3 Measurement of Expressed S Antigen ……………………………….37 2.9.4 Measurement of Antibody Responses ………………………………..38 2.9.5 IFN-r ELISPOT Assay ………………………………………………38 2.9.6 HBsAg Seroconversion Analysis ……………………………………38 ΙΙΙ. RESULTS .. ...........................................................................................................40 3.1. Establishment of HB-110 Production Process……………………..………40 3.1.1 Cell Line Preparation………………………………………………...40 3.1.2 Fermentation Process………………………………………………...40 3.1.3 Purification Process…………………………………………………..45 3.1.3.1 Thiophilic/aromatic adsorption (TAA) chromatography…………45 3.1.3.2 Flowchart of Overall Manufacturing Process……………………45 3.1.3.3 Yield per Purification Step and In-process Test…………………..48 3.2 CMC Study……………………………………………………………….48 3.2.1 Physicochemical Characterization…………………………….……..48 3.2.2 Biological Characterization………………………………………….51 3.3. Quality Assessment Specification………………………………………....51 3.3.1 Quality Assessment Items and Specifications for HB-110 plasmid DNA ……………………………………………………………………………51 3.3.2 Establishment and Validation of HBcAg Quantification……………...56 3.3.3 Identification of the Expression of L and Polymerase Proteins………..56 3.4 Stability Tests……………………………………………………………...56 3.4.1 HB-110 Long-term Stability Test ………………………………….....56 3.5 Safety Evaluation………………………………………………………......60 3.5.1 Material for Safety Evaluation………………………………………..60 3.5.2 Safety Assessment in Small Animals and Monkeys…………………..60 3.6 Pharmacokinetic Study…………………………………………………….62 3.6.1 In Vivo Kinetics of HB-110 after Intravenous Administration………...62 3.6.2 In Vivo Kinetics of HB-110 after Intramuscular Administration……....62 3.6.3 Tissue Distribution of HB-110 after Intramuscular Administration…....67 3.6.4 Evaluation of Biodistribution using RT-PCR…………………………67 3.6.4.1 Pharmacokinetics after a Single Dose…………………………....67 3.6.4.2 Pharmacokinetics after a Repeated Dose…………………………70 3.7 HB-110 manufacturing for Phase 1 Clinical Trial…………………………..72 3.8 Phase 1 Clinical Trial………………………………………………………74 3.9 Study of Electroporation Application……………………………………..74 3.9.1 HBs Antigen Expression……………………………………………..74 3.9.2 Antibody Responses……………………………………………….....77 3.9.3 Cellular Immune Response…………………………………………..81 3.9.4 HBsAg Seroconversion Analysis…………………………………….85 3.9.5 Conclusion of Electroporation Study………………………………....85 ΙV. DISCUSSION ......................................................................................................87 V. REFERENCES ......................................................................................................91 국문초록..................................................................................................... ……….96 APPENDIX .............................................................................................................. 98 Appendix 1. Safety assessment in small animals……………………………98 Appendix 2. Identification of anti-HBs Ab after 6 month repeated HB-110 dose in monkeys……………………………………………………99 Appendix 3. Safety results of HB-110 phase 1 clinical trial………………..100 Appendix 4. HBe Ag seroconversion rate of HB-110 phase 1 clinical trial....101 Appendix 5. Publications……………………………………………….....102Docto