Modulation of sugar transport for improved production of 3-hydroxypropionic acid (3-HP) in engineered Escherichia coli

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 바이오엔지니어링전공, 2015. 8. 서진호.Since xylose is the second abundunt sugar next to glucose in lignocellulosic biomass, production of various chemicals by using xylose as a carbon source is important. 3-Hydroxypropionic acid (3-HP) was selected as a target material which is a precursor for various chemicals including acrylic acid, methyl acrylate and acrylamide. However, production of 3-HP from xylose showed glycerol accumulation during cultivation. Because the glycerol accumulation is known for inhibiting glycerol dehydratase which is a key enzyme in biosynthesis of 3-HP, alleviating glycerol accumulation is necessary to increase 3-HP production. The crr and ptsHI genes are known for encoding the PTS system. The phosphorylated CRR protein inhibits glycerol uptake when xylose remained in media by activating transcription of catabolite-repressed genes, and the phosphorylated HPR protein encoded by the ptsHI genes inhibits glycerol uptake by combining with a glycerol facilitator. Therefore, deletion of the crr and ptsHI genes involved in inhibition of glycerol uptake are necessary. Although deletion of the crr and ptsHI genes decreased glycerol accumulation by 30% relative to the control strain, this strategy also reduced xylose uptake rate and 3-HP concentration. As another way to resolve the glycerol accumulation problem, the genes for sugar transporters, galP, glpF and xylE, were expressed constitutively under the endogenous E. coli promoter. The galP gene encoding galactose permease and the glpF gene encoding glycerol facilitator are overexpressed when the glycerol is used as a sole carbon source. The xylE gene encoding xylose symporter is expected to enhance xylose uptake rate. As a result, the strain overexpressing the galP gene decreased glycerol accumulation by 55% compare with the control strain without reducing 3-HP concentration. The strain overexpressing the glpF and xylE increased glycerol accumulation by 25% and 58% relative to the control strain, respectively. To clarify this result, fermentation was carried out in R/5 medium containing 20 g/L xylose. The batch fermentation resulted in 4.01 g/L of 3-HP and 5.71 g/L of DCW without accumulation of glycerol. Expression of the galP gene which was identified by Western blotting seemed to redirect the carbon flux from glycerol to cell mass. To produce high concentration of 3-HP, a fed-batch fermentation using the galP overexpressed strain was carried out by feeding xylose continuously resulted in 39.1 g/L of 3-HP concentration and 0.40 g/L?h of 3-HP productivity without accumulation of glycerol.ABSTRACT i CONTENTS iv LIST OF TABLES vii LIST OF FIGURES vii Chapter 1. INTRODUCTION 1 1.1 3-Hydroxypropionic acid 1 1.2 Hemicellulose and xylose 5 1.3 Metabolic pathway from xylose to 3-HP in E. coli 7 1.4 Phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system 9 1.5 Transporter 10 1.6 Research objectives 11 Chapter 2. MATERIALS AND METHODS 12 2.1 Strains and plasmids 12 2.2 DNA manipulation 14 2.2.1 Gene deletion 14 2.2.2 E. coli transporter expressing plasmid vector construction 16 2.3 E. coli gene deletion progress 16 2.3.1 Preparation of kanamycin resistance cassette 16 2.3.2 Expression of λ red recombinase in host strain 17 2.3.3 Kanamycin resistance cassette insert to expression strain 17 2.3.4 Recombination and adaptation 17 2.3.5 Elimination of kanamycin resistance cassette 18 2.4 E. coli transporter DNA manipulation and transformation 18 2.4.1 Preparation of DNA 18 2.4.2 Polymerase chain reaction 18 2.4.3 Digestion and ligation of DNA 19 2.4.4 Transformation 19 2.5 Culture conditions 20 2.5.1 Media 20 2.5.2 Flask culture 20 2.5.3 Batch fermentation in a bioreactor 21 2.5.4 Fed-batch fermentation in a bioreactor 21 2.6 Analytical methods 22 2.6.1 Dry cell weight 22 2.6.2 High performance liquid chromatography analysis 22 2.6.3 SDS-PAGE 23 2.6.4 Western blot 23 Chapter 3. RESULTS AND DISCUSSIONS 25 3.1 Production of 3-HP from xylose 25 3.1.1 Problem of glycerol accumulation during culture 25 3.2 Catabolite derepression 28 3.2.1 Deletion of crr and ptsHI genes 28 3.2.2 Sequences of crr and ptsHI genes 28 3.2.3 Confirmation of gene deletion 31 3.2.4 Flask culture of PTS system deleted strains 31 3.3 Expression of E. coli transporters 36 3.3.1 Sequences of galP, glpF, xylE 36 3.3.2 Construction of E. coli transporter expression strain 41 3.3.3 Flask culture of transporter overexpression strain 43 3.3.4 Batch fermentation 43 3.4 Confirmation of galP expression 48 3.4.1 SDS-PAGE & western blot 48 3.4.2 Effect of galP expression on glycerol metabolism 51 3.5 Production of 3-HP from xylose in galP expression strain 53 3.5.1 Fed-batch fermentation using xylose feeding strategy 53 Chapter 4. CONCLUSIONS 55 Chapter 5. REFERENCES 56 Abstract (In Korean) / 국문초록 60 List of Tables Table 1.1 3-HP based product opportunities 3 Table 1.2 Research of 3-HP production 4 Table 1.3 Polymer composition of lignocellulose 6 Table 2.1 List of strains and plasmids used in this study 13 Table 2.2 List of primers used in this study 15 Table 2.3 Composition of 14% polyacrylamide gel for SDS-PAGE 24 Table 2.4 Composition of buffers used in western blot 24 Table 3.1 Results of PTS deletion strain in flask culture 35 Table 3.2 Results of transporter expression strain in flask culture 45 Table 3.3 Results of batch culture in fermentor 47 Table 3.4 Results of fed-batch fermentation 54 List of Figures Figure 1.1 Structure of xylose 6 Figure 1.2 Biosynthesis pathway to 3-HP from xylose in recombinant E. coli 8 Figure 3.1 100 mL flask culture of ?gyp/pELDRR/pCPaGGRmut in R/5 medium containing 10 g/L xylose 27 Figure 3.2 Confirmation of crr and ptsHI gene disruption 33 Figure 3.3 Results of flask culture PTS deletion strain in xylose medium 34 Figure 3.4 Genetic maps of pCPaGGRmutgalP, pCPaGGRmutglpF and pCPaGGRmutxlyE 42 Figure 3.5 Results of flask culture transporter expression strain in xylose medium 44 Figure 3.6 Results of batch culture in xylose medium 46 Figure 3.7 SDS-PAGE analysis of pCPaGGRmut and pELDRR plasmid expression 49 Figure 3.8 Genetic map of pCPaGGRmutgalP introduced his tag 50 Figure 3.9 Western blot analysis of galP expression 50 Figure 3.10 Results of flask culture ?gyp/pCPaGGRmut and ?gyp/pCPaGGRmutgalP in xylose medium 52 Figure 3.11 Profile of fed-batch fermentation of ?gyp/pELDRR/pCPaGGRmutgalP 54Maste

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학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 국어국문학과, 2016. 2. 조현설.본고는 「오누이 힘내기」 설화를 공모형과 희생형으로 나누어 화자들의 실제 담론에서 생산되는 다양한 의미들을 규명하고자 하였다. 서사 내용보다는 실제 담론 층위를 주목하여 설화가 전승 주체인 화자들에 의해 어떻게 표현되고, 전승되고 있는지 살펴보는 데 연구의 주안점을 두었다. Ⅱ장에서는 자료를 개관하고 유형을 설정하였다. 「오누이 힘내기」는 어머니와 누이라는 두 ‘여성’을 주체로 삼으면 공모형과 희생형으로 구분된다. 전자는 어머니가 누이를 방해하는 유형이고 후자는 누이가 스스로 희생하는 유형으로, 두 여성의 공모와 희생이 누이를 제거하는 데 결정적으로 기여하고 있다. 이 공모와 희생은 서사상으로도 중요한 분기점이 되지만 연행상으로도 화자들의 가장 큰 관심을 끄는 사건이다. 공모형과 희생형은 주요 전승 지역, 전승 형태, 전승 집단의 성별 구성 등에 있어서도 대조를 보인다. 이를 바탕으로 Ⅲ장에서는 ‘인물’, ‘증거물’, ‘후일담 혹은 관련 삽화’의 분석 준거를 통해 공모형과 희생형의 형상화 방식을 논의하였다. 먼저 공모형의 인물 구성과 관련하여, 화자에 의해 인물의 행위가 동기화되고 어머니와 누이의 대립이 생생하게 재현되는 한편 내면 심리가 제시되는 등 인물과 사건이 구체적으로 형상화되는 양상을 지적할 수 있다. 이때 어머니의 행위가 동기화되고 내기의 배경이 제시되면서 외부 환경과의 갈등이 심화되기도 한다. 또한 공모형에는 비교적 다양한 증거물들이 분산적으로 제시된다. 공모형은 각종 성․탑․다리를 기본 증거물로 하여 전승되지만 경우에 따라서는 누이의 죽음과 관련된 무덤, 바위 등의 추가 증거물이 나타난다. 한편 이몽학, 임연 등의 역사인물이 오라비로 등장하면서 ‘인물 증거물’이 되기도 하지만 인물의 역사적 사실과 힘내기 이야기의 관련성은 비교적 약하게 나타난다. 마지막으로 공모형은 내기 이야기 뒤에 후일담이 붙어 각편이 확장되는 경우가 있다. 공모형의 후일담들은 누이의 억울한 죽음, 어머니와 오라비의 비극적 최후 등을 추가적으로 설명한다. 이들은 대부분 본담에 계기를 두며 추가 증거물들을 보다 효과적으로 제시하는 데 기여하기도 한다. 그러나 오라비의 역적담은 오히려 ‘어머니-오라비(아들)’ 모자지간 혹은 ‘오누이 가족-국가’의 갈등을 부각시키는 경우가 있다. 반면 희생형의 경우, 먼저 인물 구성을 살펴보면 모든 각편에서 오누이가 ‘누나와 남동생’으로 나타나는데 두 사람은 주로 ‘힘과 지혜가 우월한 누나-오만하고 폭력적인 남동생’이라는 대조적 모습을 보인다. 이때 화자들의 관심은 주로 누나에 있으며 누나의 눈과 목소리를 통해 작중 상황이 묘사․전달되는 경우가 빈번하다. 그러나 남동생을 위해 스스로 패배를 선택한 누나의 선택과 그의 퇴장 또한 당연시된다. 각편에 따라서는 누나의 죽음이 생략되거나 화자의 개인 해석에 따라 부정되는 경우도 있다. 희생형의 증거물은 인물 증거물에 대하여 구심적으로 제시된다. 희생형은 주로 김덕령․이방실․임경업․정여립․송팔영 등의 남성 역사 인물들을 중심 증거물로 하여 전승되기 때문이다. 흥미로운 점은 본담에서 ‘작중 인물’로 형상화되는 남동생과 인물 증거물로서 형상화되는 역사인물의 이미지가 균일하지 않다는 점이다. 화자들은 ‘남동생’에게는 부정적인 태도를 드러내면서도 ‘김덕령’에 대해서는 연민과 존경의 태도를 보인다. 희생형에도 추가 증거물이 제시되는 경우가 있으나 역사인물을 보조하는 경우가 대부분이며, 누나와 관련된 추가 증거물은 거의 나타나지 않는다. 또 희생형에서는 주로 남동생 인물과 관련된 삽화가 본담의 앞․뒤에 결합하여 각편을 확장시키는 양상이 관찰된다. 삽화들은 인물을 재해석하기보다는 인물의 고정적 특성을 설명하는 데 충실하다. 삽화들은 본담과의 인과 관계 혹은 계기성보다는 인물이야기 전체의 구성방식에 영향을 받고 있으며, 결과적으로는 남동생 인물 중심의 전승 체계를 안정적으로 유지하는 요소로 기능한다. Ⅲ장의 형상화 방식 논의를 바탕으로 Ⅳ장에서는 유형별 전승 의미와 유형 간 관계를 고찰하였다. 공모형과 관련하여 우선 어머니와 지배 질서를 통해 누이 제거가 정당화되지만 동시에 그에 반발하는 균열적 지향이 함께 발견된다. 대리인 어머니 그리고 남성 지배(가부장제) 질서와 국가 권력에 의해 누이의 제거는 효과적으로 정당화된다. 그러나 누이의 죽음을 석연치 않은 것으로 여기고 그를 연민하는 화자들의 인식이 분명히 확인된다. 이는 남성 지배 질서와 국가 권력에 대한 반항이 나타난 결과로 해석되며, 누이에 대한 연민과 근친 살해에 대한 금기 의식 등이 표출된 것으로도 볼 수 있다. 이러한 ‘균열’의 징후는 구체적으로 어머니 및 누이에 대한 여성 화자의 연민, 실패한 오라비 장수에 대한 반감 표출, 모성의 이상성 파괴 등을 통해 드러난다. 그러나 이러한 균열적 지향이 완전한 ‘탈주’로 이어지지는 않는다. 누이에 대한 화자들의 연민이 드러나기는 하지만 이것이 누이 제거를 정당화하는 지배 질서의 완전한 전복으로 나아가지는 못한다. 또한 누이 제거의 근본적 배후가 되는 남성 지배 질서는 국가 권력에 비해 보다 ‘자연적’인 질서로 표현되며, 여성 화자들의 연민 및 공감에는 가부장제 내 어머니와 누이라는 두 가지 정체성 수행이 착종되어 있다. 다음으로 희생형과 관련해서는 역사인물을 통해 누나 제거가 정당화되면서도 누나에 대한 굴절된 이상화가 이루어지는 역설이 주목된다. 남동생은 본담에서는 비교적 부정적인 인물로 형상화됨에도 인물 증거물로서는 전승자들로부터 지지를 받고 있다. 그런데 희생형의 주요 역사인물들은 억울하게 죽었지만 실제 반역을 일으킨 것은 아니며 사후 국가로부터 ‘진정한 충신’으로 인정받은 이들이다. 따라서 이들에 대한 전승담당층의 지지는 오히려 지배 체제에 우호적일 가능성이 크다. 본고에서는 이러한 지지에 역사인물을 ‘억울하게 죽이지 않았을’ 국가 권력에 대한 ‘환상’이 반영되어 있다고 보았다. 아울러 이러한 인식이 희생형 누나에 적용될 경우, ‘살아서 김덕령을 도와 그를 진정한 영웅으로 만들어 줄 수 있었지만’ ‘결코 김덕령을 이겨서는 안 되는’ 역설이 투영된 ‘이상적 여성상’을 낳게 된다고 해석하였다. 마지막으로 「오누이 힘내기」라는 하나의 설화 안에서 공모형과 희생형이 맺는 관계 및 유형의 변모에 대해 살폈다. 먼저 공모형 누이의 ‘축조’가 희생형 누나의 ‘직조’로 변한 것을 지리산 선도성모/마고할미와 무가 「성주본가」의 황우양씨 부인의 전변과 연결시켜 이해하였다. 남편과 옷의 존재가 마고할미와 황우양씨 부인의 변신과 밀접한 관련을 맺는 점에 착안하여 누이 형상의 전변에도 역사적 남성 영웅 오라비의 존재가 결정적인 영향을 미쳤다고 보았다. 그러나 희생형의 파생에 영향을 미친 것은 역사인물의 존재 자체보다는 애국 행위와 억울한 죽음 등을 통해 강력한 증거력을 보유하게 된 역사인물의 성격이라고 할 수 있다. 이와 맞물려 ‘공모’와 ‘희생’의 주체가 되는 두 여성 인물, 어머니와 누나의 관계를 살펴보면서 희생형에 이르러 여성 인물에 대한 담론이 상당 부분 단일화됨을 지적하였다. 공모형의 어머니는 누이의 간접적 살해자나 다름없지만 동시에 존재 자체가 지배 담론의 균열에 기여하는 측면이 있다. 반면 희생형에서는 어머니의 존재 자체가 아예 사라져 있고, 누나의 제거는 보다 무리 없이 긍정된다. 대신 희생형 누나에는 공모형 어머니의 모습이 상당 부분 흡수되어 있으며, 누나의 패배에 대한 화자들의 인식도 큰 차이를 보이지 않는다.I. 서론 1 II. 자료와 유형 10 1. 연구 자료 10 1.1. 연구 대상 및 자료 10 1.2. 현지 조사 12 2. 유형 분류 15 2.1. 여성 인물과 유형 설정 15 2.2. 공모형 20 2.3. 희생형 25 III. 유형별 형상화 방식 32 1. 공모형 33 1.1. 누이와 어머니 중심의 인물 구성 33 1.2. 다양한 증거물의 분산적 제시 48 1.3. 후일담을 통한 누이 서사의 연장 57 2. 희생형 69 2.1. 누나와 남동생의 대조적 인물 구성 69 2.2. 역사인물 관련 증거물의 구심적 제시 77 2.3. 삽화를 통한 역사인물 중심의 전승 83 IV. 유형별 전승 의미와 유형 간 관계 91 1. 공모형 92 1.1. 대리인 어머니와 지배 질서 92 1.2. 지배 질서에 대한 균열적 지향 96 1.3. 균열의 한계와 담론의 착종 104 2. 희생형 109 2.1. 남동생에 대한 이중적 인식 109 2.2. 누나의 굴절된 이상화 112 3. 유형 간 관계와 변모 121 3.1. 축성 담론에서 직조 담론으로 121 3.2. 역사적 남성 영웅의 개입과 담론의 단일화 128 V. 결론 137 참고문헌 141 부록 149 1. 구비 채록 자료 목록 149 2. 현지 조사 채록본 160 中文摘要 188Maste