단일 세포 유전자 발현 분석을 위한 미세우물구조 기반의 유전자 정량 분석 구현

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 전기·컴퓨터공학부, 2013. 8. 권성훈.본 논문에서는 단일 세포 유전자 발현의 정량분석을 위한 다중적 부피를 갖는 미세우물구조 기반의 접근법을 제안하고 이를 구현한다. 세포는 모든 살아있는 생명체의 구조적, 기능적인 가장 기본적인 단위로서 다양하고 복잡한 생명현상의 본질을 이해하기 위한 가장 기초적인 요소이다. 수많은 복잡한 생명현상들이 세포들의 기작 및 세포간 혹은 세포와 외부 환경간의 상호작용에 의해 이루어지는 데 반해, 분자 생물학 및 세포 생물학 분야의 대부분의 연구는 수많은 세포들의 집단적인 평균적 겉보기 활동에 대한 관찰 및 해석에 의해 이루어져 왔다. 이는 기존의 전통적인 세포 분석 방법들의 기술적 수준의 한계에 따른 것인데, 세포의 생명활동과 관련하는 여러 가지 현상에 대한 보다 정확한 관찰 및 분석이 요구됨에 따라 기존에 이루어져 왔던 연구 방법들을 단일 세포 단위로 접근할 수 있는 진보된 기술의 필요성이 점차적으로 증가하고 있다. 다양한 종류의 분자 생물학적 분석법 가운데 본 연구에서는 유전자 정량 분석에 주목하였다. 유전자 세포 내 유전자 발현량은 세포의 기능적 활동을 결정짓는 단백질 발현과 직접적인 관련성을 가지기 때문에 세포의 생명 현상적 상태를 파악 하는 데에 주요 지표로 활용될 수 있다. 또한 하나의 생명체를 이루는 수많은 세포들이 거의 동일한 유전체 정보를 가지는 데에 반해 유전자 발현량은 내∙외부적 환경에 따라 세포마다 다르게 나타나기 때문에 단일 세포 단위의 분석이 특히 요구된다. 최근 반도체 미세 공정 및 바이오칩 기술이 발전함에 따라 기존의 유전자 정량 분석법들로는 수행하기가 어려웠던 단일 세포 단위의 유전자 정량분석의 가능성을 높이는 기술들이 조금씩 개발되고 있다. 본 논문에서는 미세우물구조를 기반으로 하는 단일 세포 유전자 정량 기술의 개발에 대한 연구를 진행하였다. 즉, 각 미세우물구조 안에 단 하나의 세포만이 들어가게끔 유도한 후 미세우물구조들을 공간적으로 분리시킴으로써 수많은 독립적인 유전자 정량 반응을 병렬적으로 얻어내는 기술에 대하여 연구하였다. 미세우물구조 기반의 단일 세포 유전자 정량 분석을 이루어 내기에 앞서 두 가지 기술적인 어려움이 우선적으로 극복되었다. 우선 미세유체소자 기반의 유전자 정량 분석 환경을 구축하였다. 수많은 미세우물구조를 포함하는 미세유체소자를 제작하고, 미세유체 환경에서 유전자 증폭 반응을 성공적으로 재현하였다. 또한 유전자 정량 분석을 수행할 수 있는 실시간 유전자 증폭 분석계를 구현하였다. 다음으로 세포의 분쇄과정과 유전자 역전사 및 증폭과정이 단일 반응공간에서 연속적으로 이루어질 수 있는 시약 조성을 확보하였다. 별도의 유전자 추출과정 없이 세포를 반응에 첨가 하였을 때 유전자 역전사 및 증폭과정에 관여하는 효소 등의 기능을 손상시키지 않으면서 세포로부터 유전자 전사물을 획득하는 시약 조건을 확립함으로써 여러 단계에 걸쳐 이루어지는 세포 내 유전자 증폭 과정을 단일 반응공간에서 이루어 내었다. 단일 세포로부터의 유전자 획득 및 증폭이 안정적으로 이루어질 수 있는 반응 환경을 구축하기 위하여 서로 다른 부피를 갖는 두 미세우물구조를 하나로 합치는 방식의 접근법을 고안하여 연구를 진행하였다. 즉, 단일 세포와 비슷한 크기를 갖는 미세우물구조를 준비하여 단일 세포들을 가둔 후에 더 큰 부피를 갖는 미세우물구조와 대응시켜 결합함으로써 각각의 단일 세포들이 필요로 하는 부피의 반응 조건에 노출될 수 있도록 유도하였다. 이와 같은 미세우물구조 기반의 단일 세포 배치 방법을 미세유체환경의 실시간 유전자 증폭 분석법 및 단일 반응공간 세포 유전자 증폭 조건과 결합함으로써 하나의 미세유체소자에서 병렬적인 단일 세포 유전자 정량 분석을 성공적으로 수행하였다. 본 연구를 통해 얻어진 단일 세포 유전자 정량분석 기술은 높은 수율과 낮은 단가의 단일 세포 유전자 정량분석을 가능케 할 것으로 기대 된다. 또한 유전자 염기서열 분석기술과 결합되어 단일 세포 전사체 염기서열 분석 등의 기술로 발전될 수 있을 것이다.In this dissertation, a development of a low-cost and high-throughput single-cell gene expression analysis method is presented. Although the cells are fundamental building block of all living organisms, most of the studies on cell biology have only been achieved on the basis of the collective behavior of large cell populations mainly due to the challenges and limitations in analytical technologies. For this reason, some researches have longed for an improved technology enabling a reliable single-cell-level analysis and they include a study on the heterogeneity of cellular characteristics and an in-depth study on rare cells such as circulating tumor cells and cancer stem cells. Single cell analysis has therefore attracted a great attention and a development of a single cell analysis method addressing important issues in the field of biological and medical sciences is required. Gene expression profiling, which measures level of cellular gene expressions, provides a picture of functional states of cells of interest, reflecting both intracellular and extracellular environments. By virtue of the capability of reporting temporal and spatial status of cellular functions, gene expression profiling is considered to be a powerful method for understanding complicated cellular behaviors depending on intrinsic cellular characteristics as well as extrinsic environmental factors. Gene expression levels may differ among individual cells in a given cell population, and therefore, gene expression analysis with a single cell resolution becomes an important concern in its applications. Here, a new methodology enabling quantification of single-cell gene expression is proposed and developed. In chapter 1, overall guidelines for dissertation are explained. Chapter 2 introduces a background and a motivation of the proposed approach utilizing a number of volume-adjusted microwells for high-throughput single-cell RT-qPCR (Reverse-Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction). In chapter 3 and 4, two major technical challenges for achieving a microwell-based single-cell RT-qPCR system are discussed respectively. Chapter 3 demonstrates a development of the microwell-based on-chip PCR platform enabling small volume PCR. The development of small-volume on-chip PCR system includes preparation of microwell arrays, implementation of a real-time PCR equipment, and their application for the realization of small volume PCR. Chapter 4 describes the determination of single-step lysis-RT-PCR condition realized within a fixed reaction volume. The obtained RT-PCR reagent condition enables direct cell-lysis followed by RT-PCR reaction within a single microwell with fixed reaction volume. A detailed discussion on the multivolume microwell array approach is dealt with in Chapter 5. Single cell trapping and subsequent confinement assisted by volume-adjusted microwell arrays are demonstrated. The integration of real-time small-volume on-chip PCR system and one-pot lysis-RT-PCR conditions is also demonstrated. Quantification of single-cell gene expression is finally performed using the integrated single-cell RT-qPCR system. The multivolume microwell array approach is expected to serve as a quantitative analysis system for single-cell gene expression analysis with low cost and high throughput. In addition to realizing the utilization of single-cell RT-qPCR in personalized medicine applications, the microwell-based single-cell analysis system is also expected to be further improved toward single-cell whole transcriptome analysis platform in combination with the use of DNA microarray technology and DNA sequencing technologies.Contents Abstract １ Contents ４ List of Figures ７ List of Tables １３ Chapter 1 Introduction １４ Chapter 2 Background and Motivation １７ 2.1 Why Single Cell Matters １８ 2.2 Single Cell Analysis Methods １９ 2.3 Quantitative Gene Expression Analysis ２１ 2.4 Main Concept: A Multivolume Microwell Array ２４ Chapter 3 Small Volume On-Chip PCR ２５ 3.1 Microwell Array Preparation ２６ 3.1.1 Design ２６ 3.1.2 Fabrication ２７ 3.1.3 Liquid Loading and Microwell Sealing ２８ 3.1.4 Investigation of Microwell Isolation ３０ 3.2 Experimental Setup and Data Analysis ３３ 3.2.1 Real-Time On-Chip PCR System ３３ 3.2.2 Data Analysis ３６ 3.3 PCR in small scale ３９ 3.3.1 Model PCR Selection ３９ 3.3.2 Small Volume Considerations ４０ 3.3.3 On-Chip PCR Validation ４４ Chapter 4 One-Pot Lysis-RT-PCR ４６ 4.1 Considerations for True One-Pot Lysis-RT-PCR ４７ 4.2 Determination of Cell-Lysis Condition ４９ 4.2.1 Thermal Lysis ５０ 4.2.2 Chemical Lysis ５２ 4.2.3 Thermostable Reverse Transcriptase ５４ 4.3 One-Pot Lysis-RT-PCR Using Cell Samples ５５ 4.3.1 Ribonuclease Inhibitors ５５ 4.3.2 Direct Lysis-RT-PCR from Cells ５９ 4.3.3 Validation of One-Pot Lysis-RT-PCR ６４ Chapter 5 Single-Cell RT-qPCR ６６ 5.1 Multivolume Microwell Array ６７ 5.1.1 Strategy ６８ 5.1.2 Volume Considerations ６９ 5.2 Single-Cell Loading and Isolation ７１ 5.2.1 Experimental Preparation ７１ 5.2.2 Single Cell Trapping ７２ 5.2.3 Microwell Assembly ７９ 5.3 Single-Cell RT-qPCR ８１ 5.3.1 PCR Conditions for an Assembled Microwell Array ８１ 5.3.2 Standard Curve Analysis ８５ 5.3.3 Single-Cell Gene Quantification ８８ 5.4 Future Work: Single-Cell Transcriptome Analysis ９１ Chapter 6 ９５ Bibliography ９８ Abstract in Korean １１０Docto

a prospective, randomized controlled trial comparing clinical and radiological outcomes between C3 laminectomy with C4-C6 laminoplasty and C3-C6 laminoplasty

학위논문(석사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의학과, 2024. 2. 김치헌.BACKGROUND CONTEXT: C3 laminectomy in cervical laminoplasty is a modified laminoplasty technique that can preserve semispinalis cervicis muscle attached to the C2 spinous process. Several previous studies have shown that, compared to conventional cervical laminoplasty, this technique can lead to better outcomes in postoperative axial neck pain and the preservation of C2-C3 range of motion (ROM) by preventing C2-3 interlaminar fusion. However, there is still a lack of understanding of total and proportional postoperative cervical sagittal alignment outcomes. PURPOSE: To assess effects of C3 laminectomy in cervical laminoplasty on postoperative cervical alignment and clinical outcomes. DESIGN: A single-center, patient-blinded, randomized controlled trial PATIENT SAMPLE: We included consecutive 126 patients diagnosed with cervical spondylotic myelopathy (CSM) or ossification of posterior longitudinal ligament (OPLL) who were scheduled for cervical laminoplasty from March 2017 to January 2020. OUTCOME MEASURES: The primary outcome measures were C2-C7 Cobb angle (CA) and Neck Disability Index (NDI). Secondary outcomes measures included other clinical outcomes and radiographic parameters including segmental Cobb angle and presence of C2-C3 interlaminar fusion. METHODS: Patients were randomly allocated to either the C3 laminectomy with C4-C6 laminoplasty group (LN group) or the C3-C6 laminoplasty group (LP group) at a 1:1 ratio. Laminoplasty was performed using a unilateral open-door technique and stabilized with titanium miniplates. Modified intent-to-treat analysis was performed using linear mixed-effect model analysis, which examined the fixed effect across both groups with longitudinal data from postoperative 1-year through 3-year. Additional analysis between four types of cervical sagittal alignment morphology was done. RESULTS: Among 122 patients who were randomly allocated to one of two groups (LN group, n = 61; LP group, n = 61), modified intent-to-treat analysis was done for 109 patients (LN group, n = 51, LP group, n = 58) who had available at least a year of postoperative data. Postoperative C2-C7 CA was not significantly different between the two groups. However, NDI was significantly different between the two groups (12.8±1.0 in LN group vs. 8.6±1.0 in LP group, p = 0.005), which exceeded the minimum clinically important difference (MCID). The postoperative C2-C3 CA was significantly greater in the LN group (7.1±0.5° in LN group vs. 3.2±0.5° in LP group, p < 0.001) while C4-C7 CA was significantly smaller in the LN group (3.9±0.8° in LN group vs. 7.7±0.7° in LP group, p < 0.001) with greater cSVA in the LN group (31.6±1.4 mm in LN group vs. 25.5±1.3 mm in LP group at postoperative 3-year, p = 0.002). Postoperative Euro-Quality of Life-5 Dimension (EQ-5D), numerical rating scores for neck pain (NRS-N) were significantly better in the LP group than in the LN group (all p < 0.05) and only EQ-5D surpassed the MCID. The C2-C3 fusion rate was significantly different between the LN group (9.8%) and the LP group (44.8%) (p < 0.001). The LN group showed higher prevalence of a specific cervical alignment morphology characterized by a sigmoid shape with proximal lordosis and distal kyphosis (S curve). This S curve demonstrated significantly unfavorable outcomes across multiple outcome variables. CONCLUSION: The impact of C3 laminectomy in cervical laminoplasty on postoperative kyphosis among patients with CSM or OPLL did not significantly differ from that of C3-C6 laminoplasty. However, C3 laminectomy in cervical laminoplasty might result in an unfavorable clinical outcome with an unbalanced cervical sagittal alignment characterized by sigmoid shape with proximal lordosis and distal kyphosis.연구배경: 경추후궁성형술에서 경추3번에 후궁절제술을 시행하는 것은 경추2번에 붙는 목반가시근(semispinalis cervicis)을 보존하 기 위해서 고안된 방법이다. 경추3번에 후궁절제술을 시행한 경우 경추3번에 후궁성형술을 시행했을 때 보다 축성경부통증을 줄여준 다는 것이 보고되었으며 더불어 경추2-3번 후궁유합 막음으로써 경추2-3번 가동범위유지에 더 우수한 결과를 보인다는 것이 보고 되었다. 하지만 경추3번에 후궁절제술을 시행했을 때 수술 후 시 상배열에 미치는 영향에 대한 이해는 부족한 상태이다. 연구목적: 경추후궁성형술에서 경추3번에 후궁절제술을 시행한 경 우 수술 후 임상 및 영상 결과에 미치는 영향을 분석하기 위해서 연구를 계획하였다. 연구방법: 단일기관, 환자맹검, 전향적 무작위배정 임상시험으로 경추성척수증(cervical spondylotic myelopathy) 혹은 후종인대골화 증(ossification of posterior longitudinal ligament)으로 2017년 3월 부터 2020년 1월까지 경추후궁성형술을 받은 126명의 환자를 대상 으로 하였다. 경추3번후궁절제술 및 경추4-6번 후궁성형술을 시행 한 후궁절제군과 경추3-6번 후궁성형술을 시행한 후궁성형군을 1:1비율로 각각 63명을 무작위 배정 하였다. 후궁성형술은 개방후 궁성형술(open door laminoplasty)로 시행하였다. 수술 후 3년 동 안 추적관찰 하였으며 수술 후 1년 이상의 추적관찰이 이루어진 환자들을 대상으로 수정된 치료의향분석(modified intent-to-treat analysis)을 실시하였다. 일차변수로 경추2-7번전만각(C2-C7 lordosis)과 경부장애척도(neck disability index, NDI)로 설정하였 으며 선형혼합모형분석법(linear mixed model analysis)을 통해 수 술 후 1년에서 3년까지 각 변수에 대한 그룹간 고정효과(fixed effect)에 대해서 통계검정을 실시하였다. 이차변수로는 경추2-3번 전만각(C2-C3 lordosis), 경추4-7번전만각(C4-C7 lordosis)등을 포 함한 영상결과 및 경부통증점수(numerical rating scores for neck pain, NRS-N), 상지통증점수(numerical rating scores for limb pain, NRS-L), 삶의질지수(Euro-Quality of Life-5 Dimension, EQ-5D) 등의 임상결과를 측정하였다. 결과: 제외기준 및 중도탈락을 제외하고 109명의 환자가 분석에 포함되었다. 일차변수 중 경추2-7번전만각(C2-C7 lordosis)은 후궁 성형군과 후궁절제군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 하지만 경부장애척도(NDI)는 후궁절제군이 통계적으로 유의하게 높은 값을 보여줬다. (후궁절제군, 12.8±1.0; 후궁성형군, 8.6±1.0; p=0.005) 그 외에 후궁절제군에서 경추2-3번전만각은 유의하게 컸 고 (후궁절제군, 7.1±0.5°; 후궁성형군, 3.2±0.5°; p<0.001) 경추4-7 번전만각은 유의하게 작았으며 (후궁절제군, 3.9±0.8°; 후궁성형군, 7.7±0.7°; p<0.001) 경추시상수직축(cervical sagittal vertical axis) 는 유의하게 컸다. (후궁절제군, 31.6±1.4 mm; 후궁성형군, 25.5±1.3 mm; p=0.002) 삶의질지수(EQ-5D)와 경부통증점수 (NRS-N)가 후궁절제군이 유의하게 나빴으나 삶의질지수만 최소 임상적중요차이(inimum clinically important difference, MCID)를 초과하였다. 경추2-3번후궁유합률(C2-3 interlaminar fusion rate) 은 후궁절제군 9.8 %, 후궁성형군 44.8 % 로 통계적으로 유의한 차이가 있었다. (p<0.001). 후궁절제군에서 근위부 후만, 원위부 전 만의 특징을 보이는 S모양의 비균등 시상배열이 후궁성형군에 비 해 유의하게 많이 발생하였으며 (후궁절제군, 29.4 %; 후궁성형군 12.1 %, p < 0.05) S형태의 시상배열을 보인 환자군은 대부분의 임상, 영상결과에서 통계적으로 유의하게 나쁜결과를 보여주었다. 결론: 경추후궁성형술에서 경추3번에 후궁절제술을 시행한 경우 경추3번에 후궁성형술을 시행한 경우와 비교하여 수술 후 경추후 만변형에 미치는 차이는 없다. 하지만 경추3번에 후궁절제술을 시 행한 경우 임상적으로는 나쁜결과를 보여줄 수 있는데 이는 S형태 의 비균등 시상배열 발생과 연관이 있을 것으로 추측한다.제 1 장 Introduction · 1 제 2 장 Method 3 제 1 절 Study design 3 제 2 절 Surgical procedure and postoperative managment 4 제 3 절 Data collection and outcomes 5 제 4 절 Statistical analysis 6 제 3 장 Results ·10 제 1 절 Patients 10 제 2 절 Operation-related characteristics 10 제 3 절 Postoperative outcome measures ·10 제 4 절 Cervical sagittal alignment pattern 13 제 4 장 Discussion 18 제 5 장 Conclusion 22 참고문헌 23 Abstract 28석

반자동 차트 어노테이션 시스템

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :공과대학 컴퓨터공학부,2020. 2. 서진욱.많은 양의 시각적 요소를 표시해야하는 차트 이미지를 수동으로 라벨링하는 것은 어렵고 반복적인 작업이다. 게다가 좋은 품질의 데이터 셋을 구축하기 위해서는 이미지의 메타데이터와 이미지가 내포하고 있는 원본 데이터도 기록되어야 한다. 본 연구에서는 차트 이미지를 통하여 데이터를 어노테이션하기 위해서 자동 완성 기능을 제공해주는 반자동 방식 어노테이션 시스템인 Autotator를 제안한다. 이 시스템을 통해 사용자는 차트의 타입이나 형태와 상관없이 데이터를 추출할 수 있다. 또한 Autotator는 차트의 타입 지정, 경계 상자 지정, 질문에 숫자 형식으로 입력하기와 같은 사용자 지정 어노테이션 작업을 지원한다. 이 시스템의 성능과 사용성을 평가하기 위하여 본 연구에서는 자동 완성 모델의 성능을 실험하고 파일럿 실험을 진행했다. 실험의 결과를 통하여 본 연구는 시스템의 유용성을 보이고 효율적인 어노테이션 작업을 위해 고려할 점을 논의하였다.Manually labeling chart images by marking a large number of visual elements is a laborious and repetitive process. Furthermore, for building a quality dataset, relevant metadata and underlying raw values should be annotated. We present Autotator, a semi-automatic annotating system that automatically provides suggestions for extracting data from chart images. Regardless of the type or appearance of charts, via Autotator, users can extract data from them. Besides Autotator supports user-defined annotation tasks such as labeling chart types, marking bounding boxes, and answering a question with a numeric format. To evaluate the performance and usability of the system, we measured the performance of suggestion models and conducted a pilot study. From our results, we present the usability of the Autotator and discuss considerations for effective annotation.1. 서론 1 2. 관련 연구 5 2.1 차트 이미지 분석 및 응용 5 2.2 어노테이션 시스템 6 3. Autotator 시스템 8 3.1 워크플로우 8 3.2 디자인 고려사항 10 3.2.1 사용자에 의한 채널 인코딩 11 3.2.2 오브젝트 디텍션 모델의 활용 11 3.2.3 색 기반 휴리스틱을 이용한 보완 12 3.2.4 딥러닝 모델과 규칙 기반 알고리즘의 조합 13 3.2.5 시각적 요소의 링킹 13 3.2.6 텍스트 상자의 정렬 14 3.3 데이터 추출 기능 15 3.3.1 인터렉션 시퀀스 15 3.3.2 자동 완성 방법 16 3.4 사용자 정의 어노테이션 작업 기능 18 4. 효용 검증 실험 20 4.1 자동 완성 모델의 성능 평가 실험 21 4.2 파일럿 실험 22 4.2.1 실험 디자인 22 4.2.2 실험 과정 22 4.2.3 실험 결과 23 4.2.4 사용자 피드백 및 정성 분석 25 5. 논의 28 5.1 자동 완성 기능과 Autotator 디자인의 재고 28 5.2 차트 재구성 32 5.3 한계점 및 발전 방향 32 6. 결론 34 영문 초록 39Maste

A case research on the substitution characteristics of the display industry

학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 테크노경영대학원, 1998.2, [ vi, 111 p. ]한국과학기술원 : 테크노경영대학원