Alternative tangential flow perfusion 배양에서 재조합 인간 혈액응고 제8인자 생산성 향상을 위한 개선된 회수장치 개발

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 바이오엔지니어링전공, 2016. 2. 김병기.본 학위논문의 목적은 ATF 관류식 배양에서 혈액응고 제8인자 (Factor VIII)의 생산 수율을 향상시키기 위한 개선된 회수장치를 제공하는 것이다. 이를 위하여 체크밸브, 핀치밸브와 타이머로 구성된 개선된 회수장치를 개발함으로써 본 학위논문의 목적을 달성하였다. 본 학위논문은 세 개의 연구로 구성되었다. 첫 번째 연구에서는 ATF 관류식 배양에서 혈액응고 제8인자 활성 회수 수율이 낮은 이유에 대하여 고찰하였다. 폰 블리브란트 인자(vWF)와 동시에 발현되는 재조합 인간 혈액응고 제8인자의 생산을 위하여 관류식 배양에 널리 사용되는 ATF 시스템, spin-filter, Centritech Lab III centrifuge 등과 같은 세 가지의 세포체류장치(cell retention device)를 평가하였다. 그 결과, ATF 관류식 배양에서 다른 두 개의 세포체류장치에 비해 바이오리액터 안의 혈액응고 제8인자의 활성이 매우 높음을 발견하였다. 더욱이, 혈액응고 제8인자 활성 회수 수율이 ATF 관류식 배양에서 다른 두 개의 세포체류장치에 비해 예상외로 매우 낮음을 발견하였다. 첫 번째 연구결과를 통해 재조합 혈액응고 제8인자 분자의 회수용기표면으로의 흡착(surface adsorption)과 불활화(inactivation)는 ATF 관류식 배양에서의 낮은 수율에 대한 주요 원인이 아님을 확인하였다. 재조합 혈액응고 제8인자의 수율은 관류식 배양에 사용되는 중공사막(hollow fiber filter membrane)의 공극 크기(pore size)를 0.2m에서 0.5m로 증가시켰을 경우에도 향상되지 않았다. 또한, 중공사막에 의한 재조합 혈액응고 제8인자 분자의 잔류가 ATF 관류식 배양에서 낮은 혈액응고 제8인자 활성 수율의 주요 원인이었음을 알아내었다. 우리는 중공사막에 가해지는 막간압력(transmembrane pressure)를 조절함으로써 혈액응고 제8인자 수율이 크게 향상됨을 보여주었다. 이러한 연구결과를 종합하여보면 막간압력의 조절이 ATF 관류식 배양에서 혈액응고 제8인자의 수율 향상을 위한 효율적인 방법이 될 수 있음을 시사하고 있다. 두 번째 연구에서는 ATF 관류식 배양에서 혈액응고 제8인자 수율을 향상시키기 위한 개선된 회수장치의 개발에 대하여 기술하였다. 본 연구에서는 막간압력을 향상시킬 수 있는 개선된 회수장치를 개발함으로써 ATF 관류식 배양에서 낮은 혈액응고 제8인자 회수 수율을 향상시킬 수 있는 가능성을 제시하였다. 개선된 회수장치에서 주요한 혁신적인 개선점은 회수를 위한 연동펌프(peristaltic pump)의 사용을 배제할 수 있는 체크밸브와 핀치밸브의 사용이다. 혈액응고 제8인자가 포함되어있는 배양상등액 회수를 위한 관이 항상 막혀있는 연동펌프 회수장치에서는 ATF 관류식 배양에서 혈액응고 제8인자 수율 향상의 중요한 요인인 막간압력을 증가시키는 데 한계가 있다. 그러나, 개선된 회수장치에서는 연동펌프 대신 체크밸브를 사용함으로써 투과압력 (permeate pressure)을 44.8% 감소시킬 수 있었으며, 이로 인해 막간압력을 96%이상 향상시킬 수 있었다. 세 번째 연구에서는 개선된 회수장치의 혈액응고 제8인자와 폰 빌리브란트 인자를 동시에 발현하는 중국 햄스터 난소세포(Chinese hamster ovary(CHO) cell)의 관류식 배양에의 적용에 대하여 기술하였다. 개선된 회수장치는 연동펌프를 사용한 종래의 회수장치와 동등한 세포성장을 보여주었다. 관류속도(perfusion rate)도 개선된 회수장치를 이용하여 성공적으로 조절되었다. 또한, 개선된 회수장치는 연동펌프와 비교하였을 때 혈액응고 제8인자 활성의 최종 회수 수율을 약 13.6배, 혈액응고 제8인자 활성의 생산 수율을 약 1.47배 증가시켰다. 개선된 회수장치에 의한 혈액응고 제8인자 활성 수율의 향상은 혈액응고 제8인자 분자의 잔류량 (the retention of FVIII:Ag)의 감소에 기인하였다. 막간압력 측정의 결과로부터, 연동펌프 회수장치와 비교 시 잔류된 혈액응고 제8인자 분자의 감소는 증가된 막간압력에 기인하며, 이러한 막간압력의 증가는 체크밸브의 특징적인 기능에 의한 것임을 알게 되었다. 결론적으로 본 연구를 통해 개발된 개선된 회수장치를 이용하여 ATF 관류식 배양에서 재조합 혈액응고 제8인자 생산 수율을 향상시킬 수 있었다. 또한, 개선된 회수장치는 재조합 혈액응고 제8인자 뿐만 아니라 다른 재조합 단백질의 생산 수율을 향상시키는데 유용할 것으로 기대된다. 본 학위논문에서 얻은 또 다른 중요한 성과는 개선된 회수장치가 ATF 관류식 배양과 같은 여과기반 관류식 배양 (filtration-based perfusion) 시스템의 내재적인 문제인 분리막오손 (membrane fouling) 문제를 근본적으로 해결할 수 있는 유망한 방법을 제시하였다는 데 있다.The purpose of this thesis is to provide an alternating harvest method for enhancing Factor VIII (FVIII) yield in alternating tangential flow (ATF) perfusion culture. This goal was accomplished by developing a modified harvest system composed of a check valve, a pinch valve, and a timer. This thesis was composed of three studies. In the first study, three cell retention devices, an ATF system, a spin-filter, and a Centritech Lab III centrifuge was evaluated for the production of recombinant human Factor VIII (rhFVIII) co-expressed with von Willebrand factor (vWF). From the results, it was found that the FVIII activity (FVIII:C) in bioreactor was significantly higher in the ATF perfusion culture than two other perfusion cultures. Moreover, the FVIII:C recovery yield was unexpectedly low in the ATF perfusion culture. Therefore, the reasons for this low FVIII:C recovery yield were studied. It was revealed that the inactivation and the surface adsorption of FVIII onto the harvest bag were not the main reasons for the low yield in the ATF perfusion culture. The FVIII:C recovery yield was not increased by the use of a hollow fiber filter with 0.5 m pore size instead of 0.2 m pore size. Additionally, the retention of FVIII molecules by the hollow fiber filter was a dominant factor in the low FVIII:C recovery yield in the ATF perfusion culture. It was demonstrated that FVIII yield was significantly improved by controlling transmembrane pressure (TMP) across the hollow fiber filter membrane. Taken together, these results suggest that TMP control could be an efficient method for the enhancement of FVIII yield in an ATF perfusion culture. In the second study, it was described the development of a modified harvest system to enhance FVIII yield in ATF perfusion culture. The main innovation of the modified harvest system is the use of check and pinch valves, eliminating the need of a peristaltic pump for harvest. In the third study, the modified harvest system was applied to perfusion cultures of Chinese hamster ovary (CHO) cells, which co-express both rhFVIII and vWF. The modified harvest system showed comparable cell growth with the conventional harvest system using a peristaltic pump. The perfusion rate was successfully controlled using the system. In addition, the modified harvest system achieved an approximately 13.6-fold increase in the final recovery yield of FVIII:C and a 1.47-fold increase in the product yield of FVIII:C compared with a peristaltic pump. Enhancement of the yield of FVIII:C resulted from the reduction of FVIII antigen (FVIII:Ag) retention. As a result of TMP measurement, the reduction of the retained FVIII:Ag was due to the increased TMP, which was caused by the characteristic function of a check valve, compared with a peristaltic harvest system. In conclusion, the modified harvest system developed in this thesis could be useful to enhance the product yield of other recombinant proteins in ATF perfusion culture. Another important point is that the system provides a promising tool to solve the fouling problem in the filtration-based perfusion system, especially in ATF perfusion culture.Chapter I. Introduction 1.1 Factor VIII 2 1.2 The instability of Factor VIII 5 1.3 The B-domain of Factor VIII 10 1.4 von Willebrand factor 13 1.5 Production of Factor VIII 16 1.6 Perfusion culture 16 1.6.1 Spin-filter 21 1.6.2 Centritech Lab III centrifuge 21 1.6.3 ATF system 25 1.7 The scope of thesis 29 Chapter II. Materials and Methods 2.1 Cell line and inoculum preparation 32 2.2 Perfusion culture 32 2.3 Dead-end filtration 35 2.4 Storage and surface adsorption experiments 35 2.5 Controlled TMP experiment 36 2.6 Perfusion culture with a modified harvest system and a peristaltic pump system 36 2.7 Measurement of TMP during the operation of ATF system 38 2.8 FVIII activity and antigen assay 39 2.9 vWF antigen assay 39 2.10 Statistical analysis 39 Chapter III. Study of the effect of transmembrane pressure on Factor VIII yield in ATF perfusion culture 3.1 Comparison of cell growth and FVIII production 42 3.2 Effect of storage temperature on FVIII:C recovery yield 43 3.3 Effect of the adsorption of FVIII molecule onto the container surface on FVIII:C recovery yield 46 3.4 Effect of the retention of FVIII:Ag by the hollow fiber filter on FVIII:C recovery yield 48 3.5 Retention of FVIII:Ag by dead-end filtration 50 3.6 Effect of the pore size of hollow fiber filter on FVIII:C recovery yield 50 3.7 Effect of TMP on FVIII:C recovery yield, FVIII:Ag yield, and vWF:Ag yield 52 3.8 Conclusions 56 Chapter IV. Development of a modified harvest system 4.1 Theoretical background 59 4.2 Peristaltic pump harvest system 60 4.3 TMP in the peristaltic pump harvest system 62 4.4 Effect of the pump speed on TMP in the peristaltic pump harvest system 64 4.5 Importance of the occlusion of the silicone tubing in the peristaltic harvest system 64 4.6 Design of the modified harvest system 65 4.6.1 Check valve 67 4.6.2 Pinch valve 67 4.6.3 Timer 68 4.7 Determination of the pinch valve off-time 74 4.8 TMP in the modified harvest system 74 4.9 Comparison of the TMP of the peristaltic pump harvest system and of the modified harvest system 76 4.10 Conclusions 82 Chapter V. Application of the modified harvest system to ATF perfusion culture 5.1 Cell growth and FVIII production 84 5.2 Analysis of recovery and product yield 86 5.3 Analysis of FVIII:Ag and vWF:Ag yield 86 5.4 Conclusions 87 Chapter VI. Conclusions and recommendations 91 References 95 Abstract in Korean 104Docto

Schleiermacher's View of Religion - On the Essence of Relgion

18세기말 서양은 미국 독립전쟁과 불란서 혁명으로 대표되는 혁명의 시대였다. 그러나 독일에서는 16세기 종교개혁 이래로 18세기말에 이르기까지 제정분리와 개인의 종교의 자유란 관점에서 정치·종교적 혁명은 일어나지 않고 있었다. 오히려 영국과 프랑스에 비교해 정치·종교적으로 독일은 낙후해 있었다. 왜냐하면 정치적으로 당시 독일은 프로이센과 오스트리아를 중심으로 한 200여 개의 도시국가로 구성되어 있었으며 여전히 신성로마제국에 속해 있었다. 18세기말 프로이센은 사상적으로 계몽주의의 절정기, 낭만주의의 태동기 그리고 스피노자 범신론논쟁과 피히테 무신론 논쟁으로 대표된다. 그러나 프로이센은 절대 왕권을 바탕으로 종교적 일치를 통해 정치적 안정을 추구하기 위해 정치·종교적 검열을 강화하던 검열의 시대였음은 흔히 간과되고 있다

레트로바이러스 감염의 초기과정에 대한 고분자 양이온의 역할

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :공업화학과,1998.Maste

(An) initial histologic study on molar intrusion of cat with the usage of permanent magnet

치의학과/석사[한글] 영구자석의 반발력을 이용하여 조직학적으로 구치부 intrusion의 소견을 보이는가를 확인하고 resin bite plane의 효과와 비교 연구하기 위하여 평균 체중 2.2k9인 영구치열 완성기의 고양이 10마리를 사용하였다. 통법의 direct bonding system으로 제작된 장치를 부착시키고 하루에 12∼14시간 마취하에서 vertical chin strap을 장착하고 5일간 사육, 광학 현미경으로 치근단 조직을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. resin bite plane을 부착시킨 군에서 조골세포와 파골 세포는 관찰되지 않았으나 치근막 섬유는 치근단 및 설측으로 경사지게 배열되어 있었다. 2. 영구자석을 부착시킨 군에서 치근막 섬유가 경사지게 배열될 뿐 아니라 파골세포가 치근단 부위에서 관찰되었다. [영문] Utilizing the repelling force of permanent magnet of find out weather it shows the findings of molar intrusion histologically and compares the result with the resin bite plane. As for the experimental animals, 10 cats of completion of permanent dentition with mean weight of 2.2kg which have flat occlusal plane of molar areas were used. I raised the cats under the condition of their being attached with manufactured appliance by direct bonding system and of their wearing vertical chin strap anesthetized for 12-14 hours per day through 5 days. Then, observing the root apex areas with lightmicroscope. The results were as follows; 1. In the group with resin bite plane, osteoblasts and osteoclasts could not find out but could find out periodontal ligment fiber obliquely angulated in the apical and lingual direction. 2. In the group with the permanent magnet, not only the obliquely angulated periodontal ligament fiber but also the osteoclasts at the apical areas were observed.restrictio

Complete characterization of ultrafast optical fields by phase-preserving nonlinear autocorrelation

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적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장 수혈의 적정성 평가

배경 : 저자들은 적혈구, 혈소판, 신선동결혈장 수혈의 적응증에 대한 대한수혈학회수혈지침과 문헌검토후 기존의 원내수혈지적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장 수혈의 적정성 평가 453침을 개정 및 보완하였고. 이를 바탕으로 작성된 수혈적정성 평가표를 가지고, 본원의 적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장 수혈의적정성을 평가하였다.방법 : 2002년에 이대목동병원에서 시행된 26예(적혈구수혈14예, 혈소판수혈 61예, 신선동결혈장 수혈 61예)의 수혈에 대해 의무기록의 후향적 조사의 방법으로 평가하였다. 결과 :적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장의 부적정사용률은 각각2.8%, 4.9% 및 44.3%이었다. 적혈구수혈 14예는 급성실혈에서의 수혈 73예와 만성빈혈에서의 수혈 71예로 구성되었는데, 각각2예씩이 부적정사용이었다. 혈소판수혈 61예는 골수부전에서의수혈 32예와 활동성 출혈에서의 13예, 급성파종성응고증에서의 6예 등의 적응증으로 구성되었다. 이중 임상적 출혈로 사용된 3예가 부적정으로 평가되었다. 신선동결혈장수혈 61예 중 34예가 적정 사용되었는데 중증 간질환에 합병증이 동반된 경우 16예, 급성 파종성혈관내 응고증 1예 및 기타 7예이었고. 27예가 부정적사용되었는데 중증 간질환에 합병증 없이 PT만 연장된 8예, 수술관련 10예, 기타 9예이었다