새로운 기전의 약물 타겟으로 알려진 NSDHL 및 PptT의 구조에 기반한 저해제 개발 연구

학위논문 (박사) -- 서울대학교 대학원 : 약학대학 약학과, 2020. 8. 이봉진.Structure-based drug design (SBDD)는 약물을 빠르고 적은 비용으로 효율적으로 개발할 수 있는 가장 효과적인 기술 중 하나이다. 이 기술에 있어서 해당 단백질의 삼차원 구조의 규명은 구조에 최적화된 화합물의 개발을 가능하게 한다. 이 기술을 이용하여 유망한 효소를 표적으로하는 의약품의 개발을 위해, 본 연구진은 호모사피엔스 유래 NAD+-dependent steroid dehydrogenase-like (NSDHL)와 결핵균 유래 4-phosphopantetheinyl transferase (PptT)의 두가지 촉매 효소에 주목하였다. 이러한 두 효소는 사람과 결핵균 주의 생물학적 대사에 있어 중요한 기능을 하는 것으로 인해 새로운 약물 개발 표적으로 주목받았다. NSDHL은 인간 콜레스테롤 합성에 필수적인 효소이며 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) trafficking pathway의 조절 인자이며, 콜레스테롤 관련 질환 및 암종에 대한 중대한 관련성으로 인해 새로운 표적 단백질로서 관심을 끌어왔다. PptT는 코엔자임A의 phosphopantethein 부분을 carrier protein 도메인의 세린 잔기에 공유결합으로 전달하며, 결핵의 세포 내 생존 및 persistence에 중요한 역할을 하여, 기존의 알려진 결핵 약물과는 다른 새로운 기작의 약물 타겟으로 알려져 있다. 본 연구에서는 기질의 결합 부위 및 결합형태에 대한 세부적인 묘사와 함께 NSDHL과 PptT 및 MSMEG_PPTase의 X-선 삼차원 결정 구조를 보고하였다. 이를 토대로, 구조 기반의 가상 스크리닝 및 생화학적 평가를 수행하여 NSDHL 및 PptT에 대한 새로운 억제제를 개발하였다. 또한, 저해능에 대한 추가 세포기반 검증은 우리의 억제제가 합리적으로 개발되었음을 밝혀냈다. 이러한 연구는 NSDHL 관련 질병 및 결핵에 대항하는 치료제 개발을 위한 좋은 플랫폼으로서 작용할 수 있다.Structure-based drug design (SBDD) is one of the most efficient techniques to accelerate drug development and make it more cost-effective. The determination of the three dimentional structure of the protein facillitates the development of well-optimized compounds based on the structural information. For development of pharmacological agents targeting novel enzymes using SBDD, we focused on two catalytic enzymes: (i) NAD+-dependent steroid dehydrogenase-like (NSDHL) from Homo sapiens and (ii) 4-phosphopantetheinyl transferase (PptT) from Mycobacterium tuberculosis. These two enzymes have been reported as novel drug targets due to their essential function in biological metabolism of human and M. tuberculsis, respectively. NSDHL is an essential enzyme in human cholesterol synthesis and a regulator of epidermal growth factor receptor (EGFR) trafficking pathways, has attracted interest as a therapeutic target due to its crucial relevance to cholesterol-related diseases and carcinomas. PptT is a crucial enzyme in intracellular survival and persistence of tuberculosis and covalently transfer the phosphopantethein moiety to a serine residue of carrier protein domain. In this study, we reported X-ray crystal structures of NSDHL, PptT and MSMEG_PPTase, which revealed a detailed description of the coenzyme-binding site and the binding mode. A structure-based virtual screening and biochemical evaluation were performed and identified novel inhibitors for NSDHL and PptT, respectively. Furthermore, further cell-based validation on the inhibitory activity revealed that our inhibitors were rationally developed. Overall, these findings could serve as good platforms for the development of therapeutic agents against NSDHL-related diseases and tuberculosis.Chapter 1. Structure-based discovery of novel inhibitors against human NSDHL with the potential to suppress EGFR activity 1 1.1 Introduction 1 1.2 Materials and Methods 4 1.2.1 Gene cloning, protein expression, and purification 4 1.2.2 Crystallization and X-ray data collection 7 1.2.3 Structure determination, refinement, and analysis 7 1.2.4 Isothermal titration calorimetry (ITC) 8 1.2.5 Size-exclusion chromatography with multiangle light scattering (SEC-MALS) 9 1.2.6 Thermal shift assay (TSA) 9 1.2.7 High-throughput virtual screening 10 1.2.8 NADH-based competitive binding assay for identifying inhibitors 11 1.2.9 Synthetic methods and characterization of a small molecule 12 1.2.10 Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCMS) 16 1.2.11 Kinetic solubility 17 1.2.12 Molecular docking 17 1.2.13 Surface plasmon resonance (SPR) 18 1.2.14 Cellular viability assay 19 1.2.15 Flow cytometry 20 1.2.16 Immunoblotting 21 1.2.17 Public data analysis 23 1.2.18 Statistical analysis 23 1.2.19 Data availability 23 1.3 Results 24 1.3.1 Overall structures of human NSDHL 24 1.3.2 Diverse features of human NSDHL structures 31 1.3.3 NAD+ binding site in NSDHL 35 1.3.4 Conformational change induced by the binding of NAD+ allows the binding of a sterol precursor to NSDHL 38 1.3.5 Human NSDHL favorably employs NAD(H) as its coenzyme in the cholesterol synthesis pathway 43 1.3.6 Development of NSDHL inhibitors based on the structural information 46 1.3.7 Proposed binding mode between compound 9 and NSDHL 54 1.3.8 Therapeutic potential of NSDHL inhibition in EGFR-driven cancer 57 1.3.9 The NSDHL inhibitor accelerates EGFR degradation to suppress EGFR-dependent signaling 63 1.4 Discussion 66 Chapter 2. Structure-based discovery of selective inhibitors against PptT from M. tuberculosis 70 2.1 Introduction 70 2.2 Materials and Methods 72 2.2.1 Gene Cloning, protein expression, and purification 72 2.2.2 Crystallization and X-ray data collection 73 2.2.3 Structure determination, refinement, and analysis 75 2.2.4 High throughput virtual screening 75 2.2.5 BpsA-PptT coupled assay for searching inhibitors 76 2.2.6 2. Cytotoxicity in eukaryotic cell 77 2.2.7 Bactericidal activity in mycobacteria-infected murine macrophages 77 2.3 Results 79 2.3.1 Overall structures of mycobacteria PPTases 79 2.3.2 Structural features and active sites of mycobacteria PPTases 82 2.3.3 Development of small molecule inhibitors to suppress PptT activity. 86 2.3.4 Identification of the selective scaffold inhibiting PptT from M. tuberculosis. 92 2.3.5 PptT inhibitor reveals the bactericidal activity in mycobacteria-infected macrophages 94 2.4 Discussion 96 References 98 국문초록 108Docto

Functional Characterization of Plant ADP-ribosylation Factor 1 Gene

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 자연과학대학 생명과학부, 2017. 8. 홍주봉.식물의 생장과 발달에 부정적인 영향을 주는 고온, 건조, 저온, 고염도와 같은 비생물 스트레스는 식물의 생장뿐만 아니라 작물의 품질과 생산성에도 큰 피해를 주게 된다. 비생물 스트레스에 의한 작물의 피해는 지구 온난화로 인한 기후변화에 의해 더 증가 될 것으로 보인다. 그렇기 때문에 비생물 스트레스에 내성을 갖는 작물을 개발하기 위하여 비생물 스트레스에서 식물체에서 일어나는 유전자 수준의 반응을 연구하는 것은 매우 중요하다. 고온스트레스를 처리한 고추(Capsicum annum)의 cDNA library에서 고온 유도성 cDNA 클론인 CaPP2C (Capsicum annum protein phosphatase 2C), CaMAPK1 (Capsicum annum mitogen-activated protein kinase 1), CaBI-1 (Capsicum annum Bax inhibitor-1)이 분리 되었고, 3개의 유전자의 전사물들은 고온스트레스 이외에 다양한 비생물 스트레스 조건에서 발현이 유도되었다. CaPP2C, CaMAPK1, CaBI-1을 CaMV 35S 프로모터의 제어 하에 Agrobacterium을 이용한 형질전환으로 담배(Nicotiana tabacum)에 과다 발현 시켰다. RNA blot 분석을 통해 CaPP2C, CaMAPK1, CaBI-1이 각각의 형질전환체 담배에서 과다발현 되었음을 확인 하였으며 이들 형질전환체 담배의 생체분석을 수행하였다. 3개의 유전자를 각각 과다발현한 형질전환체는 대조군 식물체와 비교한 결과, 그들의 형태적 차이를 확인 할 수 없었고 비생물 스트레스에도 내성을 보이지 않았다. 3개의 유전자를 각각 과다발현한 형질전환 식물체의 전사체 분석에서, 공통적으로 ARF 유전자의 상향조절이 확인 되어, ARF 유전자가 비생물 스트레스에 기능을 가질 것이라 예상하여 담배에서 ARF 유전자를 분리하였다. 분리된 9개의 담배 ARF cDNA 클론중 NtARF1 (Nicotiana tabacum ADP-ribosylation factor 1 )이 CaPP2C 형질전환체 담배에서 높은 수준으로 발현되는 것이 확인 되었고, NtARF1의 전사물은 고온스트레스에 의해 발현이 유도되는 것이 확인되었다. NtARF1의 식물체내에서의 기능을 연구하기 위하여 NtARF1을 과다발현 시킨 형질전환체 담배를 제작하였다. 생체 분석 결과에서 NtARF1 형질전환체 담배는 대조군 식물체와 비교하여 생장률, 식물 높이 및 각각의 식물체에서 발달된 꽃의 개수가 증가하였으며 빠른 종자 발아율을 보여 주었다. 또한 비생물 스트레스 조건인 고온, 건조, 저온, 고염도에서 NtARF1 형질전환체 담배는 대조군 식물체와 비교하여 높은 생장률에 의해 스트레스에 대한 내성이 증가하는 것이 확인 되었다. 전체 유전체 서열이 분석된 야생식물 및 작물들의 database를 이용하여 ARF family protein을 분류하였다. 계통학적 분류를 통해 ARF family protein는 4개의 Class로 나누었으며 Class1 ARF가 모든 야생식물 및 작물들에서 가장 많이 존재하였으며 특히 야생식물과 비교하여 작물에서 Class 1 ARF가 많은 숫자가 존재하였다.1. 서론 1 2. 1장 CaPP2C, CaMAPK1, CaBI-1 유전자가 과다발현된 형질전환 식물체의 비생물 스트레스 내성에 관한 연구 5 2.1 서론 5 2.2 재료 및 방법 10 2.3 결과 17 2.4 고찰 54 3. 2장 NtARF1 유전자의 식물생장 및 비생물 스트레스와의 연관 관계 58 3.1 서론 58 3.2 재료 및 방법 64 3.3 결과 72 3.4 고찰 106 4. 3장 야생식물과 작물들에서의 ARF의 분류 및 비교 114 4.1 서론 114 4.2 재료 및 방법 117 4.3 결과 119 4.4 고찰 141 5. 결론 144 6. 참고문헌 146 ABSTRACT 157Docto

무선 Ad Hoc 통신망 지원을 위한 프로토콜 연구

Thesis (doctoral)--서울대학교 대학원 :전기.컴퓨터공학부,2001.Docto

평판 내 전방향 전단수평파를 사용한 향상된 가상 시역전 영상화

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 공과대학 기계항공공학부(멀티스케일 기계설계전공), 2018. 8. 김윤영.실시간 구조 안전 모니터링 분야에서는 유도 초음파를 사용하여 평판 내 결함을 검출하는 방법들이 널리 연구되어 왔다. 대부분의 앞선 연구들에서는 램파를 사용하였기에, 전파 과정에서 발생하는 램파의 분산 특성과 다중 모드 변환 특성을 완화하기 위해 상당한 노력을 기울어야 했다. 이에 반해, 평판 내 결함 검출에 적합한 전파 특성을 지니고 있으나 전체 방향으로 균일하게 전단수평파를 발생시키고 검출할 수 있는 효과적인 방법들이 부족하여, 전단수평파는 평판 내 결함 검출에 널리 사용되지 못하였다. 특히 전단수평파 트랜스듀서의 주파수 응답 특성을 보상하는 데 중점을 두고 전방향 전단수평파를 사용하여 결함 평판들의 영상을 구현하는 방법을 본 논문에서 제시한다. 주파수 의존적인 트랜스듀서의 특성은 영상 화질에 상당히 영향을 줄 수 있기 때문에 신뢰할 수 있는 진단 영상을 갖기 위해 트랜스듀서의 주파수 응답 특성의 보상은 필수적이다. 따라서, 단순하면서도 효과적이어서 고속 영상 처리에 적합한 전방향 자기 변형 패치 트랜스듀서의 전달 함수를 나타내는 모델을 개발하였다. 금속 평판들 내 구조 결함들의 위치와 형상을 시각화하기 위하여, 가상 시역전 영상 방법을 사용하고 영상 처리 과정에서 전방향 자기 변형 패치 트랜스듀서의 전달 함수들의 영향을 보상하기 위해 2 가지 대안 기술들을 고려하였다. 이 결과로 향상된 가상 시역전 영상 방법을 적용한 몇몇 금속 평판들의 영상들에서 결함의 위치를 명확하게 파악할 수 있었다. 이러한 희망적인 실험 결과들은 전단수평파를 기반한 향상된 가상 시역전 영상 방법이 평판 구조물에 효과적인 검사 방법이 될 수 있음을 보여 준다. Abstract ⅰ Table of contents ⅲ List of tables ⅵ List of figures ⅷ Chapter 1 Introduction 1 1.1 Research motivation 1 1.2 Research objectives 6 1.3 Thesis outline 7 Chapter 2 Ultrasonic guided waves in plate structures 14 2.1 Chapter overview 14 2.2 Ultrasonic guided waves in plate structures 15 2.2.1 Governing equations for stress wave motion 15 2.2.2 Lamb waves in thin plate with free spaces 18 2.2.3 The propagation of SH waves in an infinite plate 24 2.3 Merits of using SH waves in plate structures 26 Chapter 3 Derivation of the OSH-MPT transfer functions 36 3.1 Chapter overview 36 3.2 Magnetostrictive patch transducer 36 3.3 Configuration of OSH-MPT 38 3.4 The transfer functions of OSH-MPT 40 Chapter 4 Virtual time-reversal method 53 4.1 Chapter overview 53 4.2 VTR process of guided waves in a thin defect-free plate 53 4.3 VTR process of guided waves in a thin plate with a defect 57 Chapter 5 Enhanced virtual time-reversal method 62 5.1 Chapter overview 62 5.2 Processes of EVTR method 1 63 5.3 Processes of EVTR method 2 64 5.4 Simulation with noises 66 Chapter 6 Preprocessing and image processing 79 6.1 Chapter overview 79 6.2 Pre-processing of the measured data 79 6.3 ATD based imaging algorithm 83 Chapter 7 Basic Experiments 88 7.1 Chapter overview 88 7.2 Basic experimental setup 88 7.3 Verification of the transfer functions of OSH MPT 89 7.4 Investigation on the threshold values of the transfer functions of OSH-MPT 91 7.5 Effect of the vertical position of the magnet on imaging 92 7.6 Signal Reproducibility according to bonding conditions 93 7.7 Performance comparison of VTR and EVTR with simple waveforms 94 Chapter 8 SH0 wave tomography and damage localization 110 8.1 Chapter overview 110 8.2 Mesures of image quality 110 8.3 Defect identification by SH0 wave tomography I 112 8.3.1 Simulation condition 113 8.3.2 Simulated diagnostic images for the plate with shallow notches 113 8.3.3 Simulated diagnostic images for the plate with adjacent notches 115 8.4 Defect identification by SH0 wave tomography II 116 8.4.1 Experimental setup 116 8.4.2 SH0 wave tomography constructed by VTR 117 8.4.3 SH0 wave tomography constructed by EVTR-Method 1 119 8.4.4 SH0 wave tomography constructed by EVTR-Method 2 120 Chapter 9 Conclusion 146 Appendix A Shape effect of the receiving OSH-MPT 148 Appendix B Shape identification by SH0 wave tomography 157 References 166 Abstract in Korean 176Docto

Abnormal Grain Growth in Fe-3%Si Steel Induced by Laser Annealing and Low Deformation

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 재료공학부, 2012. 2. 황농문.Fe-3%Si steel에서의 [001]방위 grain의 선택적 비정상 입자성장 현상(Abnormal Grain Growth)은 1935년 N.P. Goss에 의하여 최초로 보고된 이후에 방향성 전기강판 생산에 있어서 핵심적인 요소로 이용되고 있다. POSCO에서 현재 생산하고 있는 방향성 전기강판도 Goss grain([001]방위)의 선택적 비정상 입자현상을 극대화 하여 이용하고 있다. 이러한 선택적 비정상 입자성장 현상의 mechanism을 이해하기 위하여 다양한 연구들이 진행되어 왔고, 본 연구 그룹에서는 sub-boundary enhanced solid-state wetting이론을 제안하고 있다. 이 이론은, 낮은 energy를 갖는 sub-boundary의 존재에 의하여 극대화 된 grain boundary energy anisotropy에 의한 solid-state wetting 현상이 비정상 입자성장시의 성장 mechanism으로 작용한다는 것이다. 방향성 전기강판의 집합조직 제어기술 개발에 있어서 가장 큰 문제점은, 복잡한 생산 공정과 2차 재결정의 정확한 mechanism에 대한 이해 부족으로 인하여 공정 변수의 변화가 2차 재결정 집합조직에 미치는 영향을 예측하기 어렵다는 점이었다. 이에, 본 연구에서는 sub-boundary enhanced solid-state wetting이론에 의한 이해를 바탕으로 하여 Goss 이외의 방위의 grain이 sub-boundary를 가지고 비정상 입자성장을 일으킬 수 있도록 집합조직을 제어하는 것을 목표로 하였다. 이를 위하여 첫째로, 0.3mm두께까지 냉간압연을 마친 Fe-3%Si steel시편에 대하여 pulse laser를 이용한 부분적 annealing을 통해 회복을 일으켜 이후의 2차 재결정 과정에서 해당 부분의 Goss이외 방위의 비정상 입자성장을 유도하였다. 둘째로, 1차 재결정을 마친 Fe-3%Si steel시편에 micro-indenter를 이용해 low deformation을 가하고 다시 1차 재결정 및 2차 재결정 과정을 통하여 해당 부분에서 Goss 이외 방위의 비정상 입자성장을 유도하였다. 두 경우 모두에 있어서 Goss 이외 방위의 비정상 입자성장 현상을 확인할 수 있었다. 또한, low deformation에 의하여 성장한 비정상 입자 성장 grain을 분석한 결과 solid-state wetting에 유리한 low energy boundary에 해당하는 ∑ 1~9의 분율이 상대적으로 크게 성장한 비정상 입자성장grain에서 높게 나타나는 것을 확인하였다Maste

Drug-loaded biodegradable membranes for guided tissue regeneration

학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :치의학과 치주과학 전공,1995.Docto

An Optimization of Polymer Flooding by Multi-objective Functions in the Depleting Reservoir

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 에너지시스템공학부, 2011.2. 강주명.Maste

파동해를 이용한 이차원 공동의 고유모드 해석

Thesis (master`s)--서울대학교 대학원 :기계설계학과,1997.Maste

Measuring rates of transcription elongation in living bacterial cells

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단일 단백질 이미징을 이용한 막단백질의 확산 변화 분석 및 적용

DoctorMembrane proteins play crucial roles in communication across the cell membrane through dynamic bio-molecular interactions. More than half of proteins are involved in cellular interactions on the plasma membrane, and these interactions determine the cell fate in response to various environmental factors. Membrane proteins have a various structure in plasma membrane including single spanning transmembrane domain, seven transmembrane domains, embedding with beta barrel and peripheral proteins. And these membrane protein regulate and mediate the function including various enzymatic activity, transporting the molecules, recognition, and signal transduction. However, among these various property, diffusion of the membrane protein on the plasma membrane is one kind of physical characters. The definition of diffusion is that the net movement of molecules from a region of high concentration to a region of low concentration as a result of random motion of the molecules. Thus, using the diffusivity of target membrane protein, we could distinguish and analyze binding state and molecular reaction progresses. To elucidate the diffusivity of target membrane protein on living plasma membrane, we utilize super-resolution based single-particle tracking microscope techniques. The 405, 488, 561, and 642 nm laser line and TIRF type objective lens equipped super-resolution microscopy enables detection of multiple individual particles using photoactivatable fluorophores linked membrane protein. And we employ the EGFR family and Syntaxin1A as a model membrane protein. At the beginning, we show a diffusional mobility alteration for analyzing the interaction between membrane protein in aqueous part and ligands in the crowded membrane of living cells. That mobility shift was sensitive to the size of the binder. And also have a molecular specificity. And alteration was caused from direct binding of proteins, not the result of signal transduction. In addition, we combine diffusion coefficient distribution of each states from imaging and Reaction Progress Kinetic Analysis (RPKA). A single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis was developed to simultaneously determine the kinetics of multiple states of protein complexes in the membrane of single living cell. The subpopulation ratios of different states were quantitatively extracted from the diffusion coefficient distribution. Using this method, we investigate the series of molecular mechanisms of EGFR induced by cetuximab. The environment of live cell membrane was extremely complex to determine the factor that related with diffusivity, so we employ the in vitro membrane and membrane protein system. Using supported lipid bilayer (SLB) system, we prove the effect of the concentration and size of extracellular domain of membrane protein in diffusion. In diluted membrane protein situation, the result of experiment and simulation shows similar as a Saffman and Delbrück model. However, in crowded and complex situation, the diffusion of membrane protein decreased after molecular binding similar to previous live cell experiment. Lastly, I apply the imaging technique to drug screening field. Screening drug candidates rapidly is the first step for developing new pharmaceutical drugs. One of the promising ways to reduce the screening steps and cost is to use directly living cells for screening, instead of using purified target proteins. The compounds screened using living cells will have more biologically activities than those screened from in vitro assays. Here I report a robust method for screening drug candidates in a living cell based on single-protein imaging. I tested three different membrane proteins of epidermal growth factor receptor (EGFR), ErbB2, and ErbB3 and found effective natural compounds for each protein. The screening method I introduce will be widely used for screening the potential drug candidates using a living cell