Intracelluar antibody to pSTAT3(Y705) as a novel motif-specific inhibitor of signal transduction

Signal transducers and activators of transcription (STATs) 단백질은 잠재적인 세포질내의 전사요소로서 세포막에서부터 핵 안으로 신호를 전달한다. STAT 구성원 중의 하나인 STAT3는 인터루킨-6 처리에 의한 급성반응요소로서 발견되었다. STAT3는 대부분의 암세포나 인간의 암에서 필수적으로 활성화된다. STAT3는 면역반응, 세포 내 변형, 생존, 암의 성장에 관련되어 있다. STAT3의 타이로신 705번 잔기의 인산화는 STAT3 단백질을 활성화시키고, 이합체화와 핵 안으로의 이동을 일으킨다. 핵 안으로 이동된 STAT3는 DNA에 붙어 하위 타겟 유전자들의 전사를 유도한다. 암의 형성에 중요한 요소인 STAT3는 암의 예방과 치료에 연구되어 왔다. 타이로신 705번째 잔기의 인산화로 인해 활성화된 STAT3 의 차단을 연구하기 위해서, phage display방법을 이용하여 타이로신 잔기 705번째가 인산화된 STAT3를 특이적으로 인지하는 항체를 만들었다. 선택된 항체는 타이로신 잔기 705번이 인산화되어 있는 STAT3부근에 특이적으로 높은 친화도로 인식할 수 있다. 우리는 또한 새로운 단백질의 특정부분에 대한 저해제로서, 세포내에서 타이로신 705 부분이 인산화된 STAT3를 인지할 수 있는 세포 내 항체를 만들었다 (세포 내 항체: Intrabody). HepG2 세포 내에서 만들어진 세포 내 항체는 인터루킨-6에 의해 활성화되는 STAT3가 핵 안으로 이동하는 것을 억제하고, 이미 STAT3의 발현 제거(knock down)를 통해 알려진haptoglobin, fibrinogen, SOCS3와 같은 STAT3의 하위 타겟 유전자의 발현을 억제시켰다. 그리고 HepG2 세포에서 인터루킨-6에 의해 발현이 억제되었던 cyclinA의 발현을 세포 내 항체의 발현으로 발현을 회복시켰다. 게다가, HepG2 세포 내에서 PMA에 의한 STAT3의 타이로신잔기 705번의 인산화가 발견되지 않고, 세린잔기 727번의 인산화가 우세하게 일어나는 상태에서 세포 내 항체는 세린잔기 727번 인산화에 의해 조절되는 유전자의 발현에 영향을 주지 않았다. 또한 세포 내 항체는 STAT3의 발현 제거(knock down)했을 때와 비교하여JNK의 활성화 정도의 차이를 보였다. STAT3의 발현을 억제하기 위해서, 발현제거(knock down), 화학적인 저해제들, 우세적으로 부정적으로 발현되는 단백질의 과다발현(dominant negative protein overexpression)이 수행되어왔다. 그러나 이러한 방법들은 다른 신호전달에 영향을 주지 않으면서 단백질의 특정부분만을 선택적으로 저해하지 못한다. 그러나 본 연구의 세포 내 항체는 다른 세포신호전달에 영향을 주지 않고 인산화된 부분만을 특이적으로 억제할 수 있다. 종합하여 보았을 때, 특정부분만을 억제하는 세포 내 항체는 세포 내에서 일어나는 단백질의 특정한 변형의 역할을 연구하는데 뛰어난 방법이 될 수 있다고 예상된다. ;Signal transducers and activators of transcription (STATs) are the latent cytoplasmic transcription factors which transmit signals from the cell membrane to the nucleus. One of the family members, STAT3 is discovered as an acute phase response factor by IL-6 stimulation. STAT3 is constitutively activated in most cancer cells and human tumors. This factor is associated with inflammation, cellular transformation, survival and proliferation of cancers. Phosphorylation of tyrosine 705 leads to STAT3 activation. Activated STAT3 is dimerized and nuclear translocated. Nuclear translocated STAT3 binds to DNA and transcribes the downstream target genes. STAT3 is the critical tumorigenic factor which has been investigated for the prevention and therapy of cancers. To inhibit the function of activated STAT3 which is tyrosine 705 phosphorylated, we generated an antibody which can recognize pSTAT3(Y705) specifically by phage display method. Selected antibody can specific recognize to the tyrosine 705 phosphorylated region of STAT3 with high affinity. We also developed the intracellular expressed antibody (intrabody) as a novel motif specific inhibitor which can recognize intracellular tyrosine 705 phosphorylated STAT3. In HepG2 cells, the intrabody blocked the nuclear translocation of IL-6 activated STAT3 and inhibited the expression of downstream target genes such as haptoglobin, fibrinogen and SOCS3 whose expression was previously reported to be down-regulated by knock down of STAT3. And IL-6 stimulated inhibition of cyclin A expression is recovered by intrabody expression in HepG2 cells. Furthermore, in PMA stimulated HepG2 cells which were dominantly phosphorylated the serine 727 region of STAT3 without detectable tyrosine 705 phosphorylation, intrabody did not affect the expression of genes regulated by STAT3 serine 727 phosphorylation in HepG2 cells. In addition, this reagent showed the different activation level of JNK compared with the STAT3 knock downed cells. To inhibit STAT3 activation, knock down of STAT3, chemical inhibitors and dominant negative protein overexpression were used. These methods could not inhibit specific sites of protein without affecting other signaling. In this study, the intrabody that we generated can specific inhibit pSTAT3(Y 705) signaling without affecting other signaling pathway. Taken together, it is speculated that site-specific inhibition of intrabody can be a distinguished reagent to analyze the specific function of site specific modification in cell signaling.Introduction 1 I. STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) 1 I-A. Structure and modification of STAT 1 I-B. JAK-STAT signaling 3 I-C. Regulation of JAK-STAT signaling 10 I-D. STAT3 function and signaling 15 I-E. Inhibition of STAT3 signaling 22 II. Antibody engineering 23 II-A. Antibody 23 II-B. Engineered recombinant antibody fragments 27 II-C. scFv generation by molecular display 31 II-C-1. Phage display 31 II-C-2. Ribosome display 32 II-C-3. Yeast display 33 II-D. Intrabody 35 Materials and Methods 39 1. Materials 39 2. Cell culture 39 3. Rabbit immunization and Antibody library construction 40 4. Phage antibody selection by panning 41 5. Phage supernatant and periplasmic extracts preparation and screening of antibodies 45 6. Subcloning to generate scFv-Fc minibody and scFv-GFP intrabody 46 7. Antibody production and purification 47 8. Immunoblot analysis and immunoprecipitation 48 9. Immunoflurescence analysis 49 10. Surface plasmon resonance 50 11. Adenovirus construction 51 12. Cell viability assay 51 13. Quantitative real-time PCR analysis 52 Results 54 1. Selection of pSTAT3(Y705) antibody in STAT3 tyrosine phospho-peptide immunized phagemid library 54 2. Selection of the Fab antibodies by Bio-panning 58 3. Screening of Fab antibodies specific for tyrosine 705 phosphorylated STAT3. 60 4. Minibody construction and characterization 64 5. Realtime interaction analysis of minibody to tyrosine 705 phosphorylated STAT3 68 6. Intracellular expressed antibody which tightly bound to tyrosine phosphorylated STAT3 in cells 71 7. Inhibitory effect of intrabody to nuclear localization of the activated STAT3 by IL-6 stimulation 76 8. Intrabody efficiently blocked the STAT3 downstream signaling cascade 80 9. Intrabody down-regulated the cell viability in IL-6 treated HepG2 cells 89 10. Intrabody inhibited the tyrosine phosphorylated STAT3 signaling without effect to the serine phosphorylation signaling 91 11. Cell signaling comparision with the knockdown of STAT3 and blocking of tyrosine phosphorylated region of STAT3 using intrabody 100 Discussion 103 References 112 국문초록 12

애기장대(Arabidopsis)에서 저온 스트레스로 인한 유전자 발현 양상 분석

To understand plant cold acclimation, ICE1(inducer of CBF expression 1) expression analysis in pollen. Pollen is known to be most cold sensitive tissue and comparative analysis of gene expression pattern alteration in cold-treated freezing tolerable tissue in Arabidopsis. ICE1 which is well-known early cold acclimation regulator showed especially low expression in pollen. When ICE1 was overexpressed by 35S promoter, cold tolerance was largely increased. It may be a result that low expression of ICE1 is one of the factor that cold sensitivity of pollen. Cold acclimation is similar to memory process and is remained traces of first cold stress. Moreover it has more effective response to second cold stress. To know gene expression alteration , analyze that gene expression patterns of Arabidopsis plants by a history of cold exposure, which were previously exposed to a cold stress and compared to those of control plants using a specialized 1.5 K cDNA microarray. When three-week-old plants pre-treated with a cold stress at 0℃ for 24 hr were allowed a further growth at 23℃ (post cold treatment) for various time periods and second cold stress treated at 0℃ for 24 hr. As a result of marked alteration in the gene expression patterns was observed at different temperature treated condition including several cold-regulated genes. Under the post cold treated condition, expression of cold related genes was opposite direction in contrast to expression of cold treated condition. Especially, photosynthesis related genes were induced which repressed under the cold treatment such as ELIPs (Early light inducible proteins). As post cold treated time passes, expression of cold related genes was gradually decreased. When second cold treat to post cold treated plants, cold tolerance related genes (such as cor, LEA, FL3-5A3, anthocyanidin synthase, HD-ZIP transcription factor 12, dehydrin, LTI65 (RD29B), and KIN1) were largely expressed or more expressed than expression of first cold late phases. These alterations are accompanied by corresponding changes in the tolerance of freezing stress suggesting that the potential relevancy of these changes to cold acclimation in Arabidopsis.; 식물의 저온 순화의 기전에 대한 이해를 증진하기 위해 저온 저항성이 낮은 조직인 애기장대의 꽃가루세포에서의 ICE1의 발현에 대한 연구와 저온내성이 큰 애기장대 조직에서의 저온 처리 후의 유전자 발현 패턴의 변화를 조사 분석하였다. 저온 순화 초기 과정에 주요한 유전자 중의 하나로 알려진 ICE1 의 발현이 저온 내성이 많은 애기장대의 꽃가루세포에서는 특히 낮았으며 이를 35S promoter를 이용하여 발현을 증가시키면 저온 내성이 크게 증진되었다. 이는 꽃가루세포의 저온민감성의 원인 중 하나가 ICE 1의 낮은 발현임을 결과이다. 저온 순화는 일종의 기억의 과정과 유사하며, 첫번의 저온 스트레스에 대한 반응의 흔적이 남게 되고, 이어지는 저온 자극에 대해서 보다 효과적으로 반응하는 특성이 있다. 이에 대한 이해를 증진시키기 위해 더불어 애기장대를 이용하여 저온에 노출 되는 기간의 차이에 따라 저온에 노출되었을 때와 저온에 노출되지 않았을 때의 유전자 발현양상의 차이를 저온 스트레스 연구를 위해 제작된 specialized 1.5K cDNA microarray를 이용하여 연구 하였다. 3주 정도 자란 식물체를 먼저 0 ℃ 에서 24 시간동안 저온 처리를 한 후에 생장이 가능한 23 ℃ 에서 처리 시간을 여러 가지로 달리한 후, 다시 두 번째 저온 처리를 0 ℃ 에서 24 시간동안 하였다. 처리하는 온도가 변함에 따라 여러 가지의 저온에 의해 조절되는 유전자들의 발현 양상이 두드러지게 변화하였다. 처음 저온 처리 후 23 ℃ 로 처리를 하면 저온에 의해 발현이 조절되는 유전자들은 저온 처리 시와 반대의 발현양상을 보인다. 특히 저온 처리 시에 발현이 억제되어 있던 ELIPs (Early light inducible proteins) 같은 광합성 관련 유전자들이 발현된다. 저온 처리 후 23 ℃ 에서 처리 시간이 길어질수록 저온에 의해 조절되는 유전자들의 발현은 점점 감소한다. 23℃ 처리 후 두 번째 저온처리를 하면 저온내성과 관련된 cor, LEA, FL3-5A3, anthocyanidin synthase, HD-ZIP transcription factor 12, dehydrin, LTI65 (RD29B), KIN1과 같은 유전자들이 처음 저온 처리 시와 같이 많이 발현되거나 혹은 처음 저온 처리 시보다 더 많이 발현된다. 이러한 유전자의 발현변화는 애기장대에서 저온 스트레스에 적응하기 위한 저온순화로 인한 적절한 변화라고 볼 수 있을 것이다.Contents GENERAL BACKGROUNG = 1 CHAPTER Ⅰ. Correlation of ICE1 expression and cold sensitivity in Arabidopsis = 4 INTRODUCTION = 5 MATERIALS AND METHODS = 8 1. Material = 8 (1) Plant sample and growth condition = 8 (2) Bacterial culture and media = 8 2. Method = 8 (1) RNA preparation and Semi-quantitative RT-PCR = 8 (2) Construction of 35S::ICE1 plasmid for construction of transgenic plants = 9 (3) Construction of 35S::ICE1 transgenic plants = 17 (4) Selection of putative 35S::ICE1 transgenic plants = 18 (5) Seed production assay = 19 RESULTS 20 1. Expression analysis in Arabidopsis tissue = 20 2. Construction of 35S::ICE1 plasmid = 20 3. Expression of ICE1 gene in Arabidopsis confer cold resistance = 20 DISCUSSION = 25 CHAPTER Ⅱ. Analysis of gene expression changes by a history of cold exposure in Arabidopsis = 27 INTRODUCTION = 28 MATERIALS AND METHODS = 30 1. Material = 30 (1) Plant sample and growth condition = 30 2. Method = 30 (1) Tissues and RNA preparation = 30 (2) Microarray hybridization and image acquisition = 31 (3) Data analysis of cDNA microarray = 33 RESULTS = 34 1. Analysis of Gene expression pattern of PT plants = 34 (1) General appearance of PT plants = 34 (2) Differential gene expression in PT plants = 34 (3) Comparison of gene expression pattern in CT and PT plants = 36 (4) Expression of cold stress recovery genes in PT plants = 48 2. Analysis of Gene expression pattern of SCT plants = 69 (1) General appearance of SCT plants = 69 (2) Differential gene expression in SCT plants = 69 (3) Comparison of gene expression pattern in CT, PT, and SCT plants = 72 (4) Gene expression of profiles of selected well-known cold related genes = 81 DISCUSSION = 82 CONCLUSION = 86 REFERENCES = 87 ABSTRACT IN KOREAN = 9

(The) concept of sex-based employment discrimination

학위논문(박사) --서울대학교 대학원 :법학과(사회법전공),2009.8.Docto

고용상의 간접차별 규제 : 미국 사례를 중심으로

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :법학과 사회법 전공,2003.Maste