성상세포와 남성생식세포의 분화 과정에서 Cep215의 기능에 관한 연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 자연과학대학 생명과학부, 2022. 8. 이건수.중심체는 대부분의 동물세포에 보존되어 있는 세포 소기관으로 주로 미세소관 형성 중심으로서 역할을 한다. 중심체는 다양한 세포 활동에 관여하고 있는데, 가장 대표적인 역할은 세포의 모양 형성, 세포 분열, 일차 섬모 형성 등이다. 중심체는 두 종류의 중심립과 그 주변을 둘러 싸고 있는 단백질 덩어리인 pericentriolar material (PCM) 으로 이루어져 있다. 그 중 Cep215는 PCM의 골격단백질로서 다른 PCM 단백질들이 잘 모일 수 있도록 해주는 역할을 하고 있으며, 특히, 중심체에서 미세소관이 자라날 수 있게 하는데 있어서 필수적인 감마 튜불린을 중심체로 끌어오는 역할을 하고 있다. Cep215는 중심체뿐만 아니라 골지 등에도 존재하고 있으며 Cep215가 위치하는 세포 소기관에서 미세소관을 뻗어내게 만들어주는 능력을 가지고 있다. 이러한 Cep215의 역할은 분열하는 체세포를 이용하여 주로 연구가 되어 왔으며, 특정 장기 형성 과정에서의 Cep215 역할은 상대적으로 잘 알려지지 않았다. 본인은 박사학위 과정 동안 뇌와 정소 발생 과정에서 Cep215의 역할에 대해 연구를 수행했다. 제 1장에서는 배아암종세포에서 유래한 P19 세포와 생쥐 태아로부터 초대 배양한 해마 유래 세포를 이용하여 성상세포의 분화과정에서 Cep215의 중요성을 확인하였다. Cep215는 성상세포의 중심체뿐만 아니라 세포질, 특히 가지에서도 관찰되었다. P19 세포에서 Cep215 유전자를 완전히 없앤 결실세포주는 성상세포로의 분화가 저하되고, 가지를 형성하지 못하여 성상세포 특유의 세포 모양을 형성하지 못했다. 하지만 Cep215 결실세포주는 신경세포로의 분화, 세포의 분열 능력, 세포 운명 결정에는 영향을 미치지 않았다. Cep215는 미세소관 형성을 통해서 성상세포의 가지 형성을 촉진한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 성상세포 분화 과정에서 Cep215가 미세소관형성을 조절함으로써 성상세포의 형태를 형성한다는 것을 확인하였다. 제 2장에서는 Cep215 결실 생쥐를 이용하여 Cep215가 남성생식세포의 발생에 미치는 영향을 확인하였다. Cep215 유전자를 완전히 제거하기 위해서 첫번째와 마지막 인트론을 타겟팅하는 전략을 이용하여 결실을 유도하였다. 이렇게 제작한 Cep215 결실 생쥐를 이용하여 다양한 장기에서 보이는 표현형을 관찰하였다. Cep215 결실 생쥐는 이전 보고된 Cep215 돌연변이 생쥐와 마찬가지로 소두증과 같은 표현형을 보였으며, 야생형 생쥐와 비교했을 때, 작은 크기의 정소를 가지는 것으로 보아 남성생식세포의 발생에 문제가 있다는 것을 확인하였다. 실제로 Cep215 결실 생쥐의 정소에는 감수분열 이후에 관찰되는 생식세포들이 전혀 관찰되지 않았다. 이 결실 생쥐에서 일어나는 감수분열 과정은 초기에 해당하는 prophase I 과정에서 멈추는 것을 확인하였고, 이 정모세포들은 세포 사멸에 취약하다는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, Cep215 결실 생쥐의 다양한 남성생식세포에서 중심체가 잘 형성되어 있다는 것을 확인하였고, 이를 통해서 이 결실 생쥐에서 보이는 표현형이 중심체의 결함에 의해서 유도된 것이 아닐 수도 있다는 것을 확인하였다. 대신에 sertoli 세포에 의해 형성되는 혈액-고환 장벽이 제대로 형성되어 있지않고, 생식세포끼리 연결시켜주는 세포간결합체의 형성이 감소되어 있다는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 본인은 Cep215 결실 생쥐의 정소에서 제대로 형성되지 않은 정소의 구조적인 환경이 어느 정도 남성생식세포의 발생에 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인하였다. Cep215는 주로 중심체에서 미세소관을 형성하는데 중요한 역할을 하기 때문에, Cep215가 결실되어 나타나는 표현형이 이렇게 다양한 방식을 통해서 나타난다는 것이 아주 흥미로운 결과였다. 이 연구는 중심체 단백질의 사소한 변화로 인해 얼마나 다양한 세포 활동이 조절될 수 있는지 제시하였다.Centrosome is a subcellular organelle that functions as a microtubule organizing center in animal cells. Centrosomes play roles in several cellular processes, such as cell morphogenesis, mitosis, and cilia formation. A centrosome consists of a pair of centrioles surrounded by proteinous matrix called pericentriolar material (PCM). Cep215, one of major PCM proteins, recruits the γ-tubulin ring complex for microtubule organization. Cep215 is also involved in microtubule organization outside the centrosome. Although the cellular functions of Cep215 have been extensively studied, its specific roles at diverse tissues are relatively less known. During my predoctoral period, I investigated the roles of Cep215 in the brain and testis tissues. In chapter I, I investigated the roles of Cep215 in astrocyte differentiation using the P19 embryonic carcinoma cells and the mouse hippocampal primary cells. Cep215 was detected in the processes of astrocytes in addition to the centrosomes. Deletion of Cep215 in P19 cells caused the defects in differential morphogenesis of astrocytes, but did not affect neuronal differentiation, cell proliferation, and cell fate determination. I found that the microtubule organizing function of Cep215 is critical for the glial process formation. Based on these results, I propose that Cep215 organizes microtubules for glial process formation during astrocyte differentiation. In chapter II, I investigated the roles of Cep215 in male germ cell development using the KO mouse in which Cep215 was totally removed by targeting specific sites at both the first and last introns. The Cep215 KO mice had microcephaly-like defects as reported previously. In addition, Cep215 KO testes were smaller than the wild type testes, suggesting defects in male germ cell development. In fact, the Cep215 KO testes were devoid of post-meiotic germ cells. Spermatogenesis in Cep215 KO mouse was arrested at prophase I and the spermatocytes were vulnerable to cell death. It is surprising that the centrosomes of Cep215-deleted germ cells appeared to be intact, suggesting that the defects in progression of meiosis by Cep215 deletion may be not caused by abnormal centrosomes. Rather, the tight and gap junctions of Sertoli cells were disorganized and the intercellular bridges among germ cells were reduced in the Cep215 KO testes. Based on the results, I propose that germ cell defects are attributed, in part, to disorganized architecture of the Cep215 KO testis. Considering the cellular role of Cep215 in the microtubule organization at centrosomes, it is astonishing that Cep215-deleted tissues generated such diverse phenotypes. This research provides an example how diverse cellular functions are regulated by a simple change of the centrosome protein.BACKGROUND 1 1. Centrosome 1 1.1. Structure of centrosome 1 1.2. Functions of centrosome 2 2. The functions of Cep215 7 2.1. Microtubule nucleation 7 2.2. Spindle formation 7 2.3. Neuronal differentiation 8 2.4. The phenotypes of Cep215 mutant mice 8 Chapter I. Roles of Cep215 in morphological differentiation of astrocytes 14 ABSTRACT 15 INTRODUCTION 16 MATERIALS AND METHODS 18 Cell culture and induction of differentiation 18 Generation of Cep215 stable cell lines in base of knockout cells 19 Plasmids and RNA interference 19 Reverse Transcription and quantitative real-time RT-PCR (qPCR) 19 Immunoblot analyses 20 Immunostaining and image processing 21 BrdU incorporation assay 22 Antibodies 22 Microtubule regrowth assay 23 EB1-GFP comet assay 23 Statistical analyses 24 RESULTS 25 The importance of Cep215 in astrocytes differentiation of P19 cells 25 Cell proliferation and cell fate determination of Cep215- deleted P19 cells 25 Reduction of the microtubule organizing activity in Cep215-deleted P19 cells 26 Importance of interaction between Cep215 and γ-TuRC for glial differentiation 27 Subcellular localization of Cep215 in primary cultured astrocytes 28 Depletion of Cep215 in mouse hippocampal cells 28 DISCUSSION 44 Chapter II. Roles of Cep215 in male germ cell development 47 ABSTRACT 48 INTRODUCTION 49 MATERIALS AND METHODS 52 Animals 52 Immunoblot analyses 52 H & E staining 53 TUNEL assay 53 Immunohistochemistry of tissue sections 54 Chromosome spreading and immunostaining analysis of mouse testis 54 Antibodies 55 Image processing 55 Statistical analyses 56 RESULTS 57 Generation and characterization of Cep215 total KO mouse 57 Histological analysis of the developing testes in Cep215 KO mouse 58 Defects in the Cep215 KO spermatocytes 58 Observation of the centrosomes in male germ cells at different developmental stages 59 Immunostaining of the isolated spermatocytes from the Cep215 KO testes 59 Defects in the testis architecture of the Cep215 KO mice 60 DISCUSSION 73 CONCLUSION 76 REFERENCES 78 ABSTRACT IN KOREAN (국문 초록) 87박

環境物質의 生體反應性에 關한 硏究 (LXIX) : L6 근육세포에서 포도당 수송능에 미치는 CdCl₂의 영향

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :약학과 위생화학전공,2002.Maste