E- and P-selectin Regulation and Intracellular Calcium Oscillation on Neutrophil Recruitment

在炎症反应过程中，血管中的中性粒细胞被内皮细胞捕获，穿越内皮细胞层到达炎症部位。选择素及其配体介导了中性粒细胞与内皮细胞粘附、滚动过程，β2整合素介导了稳定粘附、跨内皮迁移等过程。Ca2+作为胞内第二信使，在中性粒细胞募集过程中起到重要调控作用。然而，上述关键粘附分子和信号分子影响中性粒细胞募集过程的机制仍不清楚。本文通过研究E-/P-选择素对中性粒细胞跨内皮迁移动力学的调控作用以及内皮细胞胞内Ca2+响应研究，阐明了中性粒细胞募集相关分子机理，深化了对炎症反应的认识。本文工作主要包括以下三个方面： （1）E-/P-选择素对中性粒细胞跨内皮迁移动力学影响：本文采用LPS对脐静脉内皮细胞（HUVEC）分别刺激4小时和12小时以获得不同的选择素表达水平，中性粒细胞在4小时LPS刺激的HUVEC上的跨内皮迁移显著高于12小时刺激的迁移结果，抗体阻断实验发现高亲和性的β2整合素直接介导了PMN的跨内皮迁移，而β2整合素的亲和性上调是E-/P-选择素分别与配体CD44及PSGL-1相互作用导致的结果。采用Gompertz函数拟合跨内皮迁移动力学曲线，通过得到的模型化参数分离出E-/P-选择素与其配体相互作用在跨内皮迁移中的独立贡献，发现E-选择素与CD44的相互作用在启动跨内皮迁移过程最慢，却使得其最快到达平台值。 （2）PMN粘附和跨内皮迁移中内皮细胞胞内钙振荡：PMN募集过程中，PMN与内皮细胞相互作用，可导致内皮细胞胞内会产生钙振荡，并引起内皮细胞骨架重组，但是其分子机制并不清楚。本文利用基于荧光共振能量转移的生物Ca2+探针技术研究选择素和整合素对钙振荡的影响，并采用奇异谱分析方法处理钙振荡的时间序列数据，提取其中的周期性变化成分。结果表明，4小时LPS刺激和12小时LPS刺激HUVEC对于钙振荡的周期没有明显不同。通过抗体阻断β2整合素，发现β2整合素影响胞内钙振荡周期。然而，细胞骨架蛋白对于HUVEC胞内钙振荡起着十分重要作用，阻断相关细胞骨架蛋白将无法发生钙振荡。 （3）基底硬度对中性粒型细胞系dHL-60胞内钙振荡的影响：血管内的PMN在募集过程中受到各种力学因素调控，比如在动脉粥样硬化中，变硬的血管会导致更多PMN的跨内皮迁移。本文通过制备0.87 kPa、5.00 kPa、34.88 kPa三种不同硬度的PA水凝胶基底来模拟在生理病理情况下血管的硬度，研究不同硬度以及不同分子相互作用对中性粒型细胞dHL-60系胞内Ca2+振荡的影响。结果显示，不同硬度对dHL-60胞内钙振荡的影响不同，基底越硬则越容易发生钙振荡；不同粘附分子的相互作用对dHL-60胞内钙振荡也不同，其中E-选择素和ICAM-1协同作用能够明显增加钙振荡。 除此之外，整合素作为介导PMN募集的异源二聚体粘附分子，其分子结构主要由结合配体的头部和起支撑作用的两条腿部结构域组成。其头部可通过I （Inserted） 或I like domain的构象变化（open或closed），调控整合素与配体结合的亲和性，然而，其腿部各结构域，如“Thigh”，“Calf-1”，“Calf-2”，“EGF-like”等对整合素与配体亲和性的作用尚不清楚。为考察腿部结构域对整合素与配体相互作用的影响，本文以β2整合素成员之一Mac-1的αM亚基为研究对象，构建一系列不同长度的腿部结构域组成的整合素α亚基蛋白，并通过转染方法成功在K562表达I domain蛋白，为未来功能性研究奠定了基础

E-选择素调控白细胞跨内皮迁移转运中内皮细胞骨架重组动力学

目的以血管稳态及重建为切入点,研究E-选择素(E-selectin)通过调节微丝骨架网络的动态重组来调控内皮细胞低阻抗区的形成,揭示导致白细胞形成更快、更多、行程更短的跨膜迁移的信号调控网络和关键分子。方法 采用Lifeact_GFP转染人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)使得内皮细胞纤维状微丝蛋白(F-actin)可视化,实时动态观察白细胞跨内皮迁移过程内皮细胞骨架重组情况。采用荧光漂白后恢复技术(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP)量化E-选择素及其配体交联下,内皮细胞不同区域的

E-选择素调控白细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞骨架重组

在炎症反应发生时,白细胞粘附并穿过血管上的内皮细胞,在炎症部位发生募集。白细胞的粘附触发了内皮细胞上粘附分子P-选择素、E-选择素、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)与微丝骨架的连接,在上述信号分子的调控下,导致微丝细胞骨架的快速、动态重组,并通过肌球蛋白轻链激酶调控白细胞的跨内皮迁移,但有关E-选择素调控微丝骨架、进而调控内皮细胞重组的现象、功能和信号转导机制目前鲜有报道

E-选择素调控白细胞跨内皮转运中内皮细胞骨架重组动力学

目的以血管稳态及重建为切入点,研究E-选择素(E-selectin)通过调节微丝骨架网络的动态重组来调控内皮细胞低阻抗区的形成,从而导致白细胞跨膜迁移增强的信号调控网络和关键分子机制。方法采用Lifeact_GFP转染人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),可使内皮细胞纤维状肌动蛋白(F-actin)可视化,并实时动态观察白细胞跨内皮迁移过程内皮细胞骨架重组动力学。采用荧光漂白后恢复技术(Fluorescence Recovery After Photobleaching,FRAP)量化E-选择素及其配体交联下,内皮细胞不同区域的细胞骨架重组能力。采用RNA干扰技术降低HUVEC上E-selectin表达,并利用AFM检测E-selectin干扰前后HUVEC各区域硬度分布,结合小分子抑制剂考察E-selectin调控细胞骨架重组从而介导白细胞跨内皮迁移的分子机制。结果白细胞跨内皮迁移过程,内皮细胞上可形成孔洞、且白细胞倾向于旁细胞迁移。FRAP结果表明内皮细胞胞体上微丝蛋白恢复速度更快,E-selectin与其配体交联可改变微丝蛋白骨架重组能力。干扰HUVEC内E-selectin表达可降低胞间连接的硬度,并增加胞间间隙的面积,有利于白细胞跨内皮迁移。采用Cyto D破坏细胞骨架、CK666抑制Arp2/3活性均可增加白细胞在对照组内皮细胞上的迁移,但是干扰E-selectin后,这些小分子抑制剂的作用消失。结论 E-选择素通过Arp2/3调节内皮细胞骨架的重组,降低胞间连接的硬度,增加胞间间隙的面积,并最终在胞间连接处形成低阻抗区,进而促进白细胞迁移

β_2整合素调控的Src信号转导

整合素是一类介导细胞-细胞、细胞-胞外基质以及细胞-病原体间粘附和信息传递的蛋白质分子,在免疫应答、凝血过程、炎症反应、肿瘤转移和创伤愈合等许多病理生理过程中起着重要的作用。β_2整合素存在与各类白细胞表面,参与白细胞与内皮细胞、免疫细胞或者靶细胞间的粘附作用。β_2整合素-ICAM-1的相互作用在白细胞-内皮细胞粘附动力学中起着至关重要的作用,并可激活下游信号转导通路。在β_2整合素介导Outside-in信号转导中,最先发生的是Src家族激酶的激活。为介导细胞信号转导,Src激酶的激活和功能行使需要在时、空上高度协调。已有研究表明

中性粒细胞调控单核细胞募集的力学-生物学耦合机制

目的动脉粥样硬是慢性的血管炎症,以炎症细胞浸润动脉血管壁为主要特征。已有研究表明在动脉粥样硬化中中性粒细胞影响单核细胞的募集,但是其募集的力-生物学耦合机制并不清楚。方法 聚焦于中性粒细胞介导单核细胞募集的力-生物学耦合机制的研究,采用了微流道技术和PA水凝胶基底制作技术结合的生物力学方法,定量考察不同基底硬度条件下中性粒细胞对单核细胞募集的影响。结果 中性粒细胞爬行过程中会形成曳尾结构(Trail),并且曳尾结构富含CD44,β2整合素等黏附分子;中性粒细胞能够通过曳尾结构上β2-ICAM-1的相互作

不同长度β_2整合素_M亚基与ICAM-1的亲和性比较

整合素作为细胞表面糖蛋白受体,介导细胞-细胞、细胞-胞外基质以及细胞-病原体间粘附和信息传递,在免疫应答、凝血反应、炎症反应、肿瘤转移和创伤愈合等许多病理生理过程中起重要作用。整合素是由α、β两个亚基非共价结合而成的异源二聚体,其结构类似于两条近平行的腿部支撑着一个球形的头部。研究表明,β_2整合素_M亚基头部的.domain为与配体直接作用的结构域,并可通过"open"或"close"的构象变

基底硬度和黏附分子的协同作用对dHL-60细胞胞内钙响应的影响

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种常见的血管疾病,它由脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成开始,伴有炎性细胞募集、纤维组织增生和钙质沉着等现象,最终导致动脉弹性减低、管腔变窄甚至阻塞动脉腔,严重危害人体健康。动脉粥样硬化等心血管疾病常伴随着血管内皮硬度的变化和炎症反应的加剧。基底硬度或黏

中国科学院力学研究所;中国科学院微重力重点实验室;中国科学院力学研究所生物力学与生物工程中心;

在炎症反应过程中,内皮细胞表面的选择素与中性粒细胞(PMN)表面的配体相互作用,介导了中性粒细胞的捕获、滚动、粘附等免疫级联反应。TNF-或Lipopolysaccharides(LPS)等炎症刺激因子的作用会提高内皮细胞表面选择素的表达[1]。已有研究表明,内皮细胞表面的P-、E-选择素与PMN表面配体的相互作用能通过PMN胞内信号通路,激活整合素到高亲和性,从而减缓PMN的滚动速度,增加粘附[2]。尽管PMN与血管内皮细胞之间分子相互作用的研究已经很多,但是P-、E-选择素对PMN跨膜迁移的影响并不清楚。本文采用LPS对脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别刺激4小时和12小时以获得不同的选择素..

中性粒细胞曳尾结构形成的力-生物学耦合机制

目的中性粒细胞(PMN)曳尾的形成对局部组织环境的重建,以及后续免疫细胞的募集至关重要,但其形成机制和对力学信号(流体剪切和基底硬度)的响应尚不清楚。方法通过荧光抗体对PMN的标志性分子Ly6G进行标记,体外监测PMN在爬行过程中曳尾的形成,利用免疫荧光技术表征曳尾形貌及其黏附分子及骨架相关蛋白的含量和分布;采用微流控技术构建不同硬度的微流道,模拟血流剪切下基底硬度对曳尾形成的调控