Feasibility study on lentiviral RNAi therapy for HIV/AIDS

艾滋病（AIDS）是一种危害极大的全球性疾病，在全世界范围内严重危害人类的健康。因此，对AIDS防治研究就具有极其重要的意义。随着耐药型艾滋病病毒（HIV）病毒株的大量出现及现有治疗方式一些难以克服的缺陷，近年来对HIV/AIDS基因治疗的研究得到了越来越广泛的重视及发展。以慢病毒载体系统结合RNA干扰（RNAi）等新兴技术的HIV基因治疗目前还存在着一系列亟待解决的问题：难以测定治疗性慢病毒滴度；缺乏有效的用于治疗效果验证的动物模型；治疗靶细胞的选择尚存在一定争议。针对这些治疗过程中重要的问题及难点，本研究借助Taqman荧光定量PCR（Q-PCR）检测及人鼠嵌合模型等手段，在多个体内外模型...AIDS is a very dangerous worldwide disease and serious harm to people’s health. So it is very significant to study on defence and therapy to HIV/AIDS. Recently more and more drug-resistant HIV has emerged and many defects of HAART have been found out. So gene therapy for HIV/AIDS has been more important to develop. Lentiviral vector system combined with RNAi has been proven a potential therapeutic...学位：理学博士院系专业：生命科学学院生物学系_生物化学与分子生物学学号：B20042603

鳞片状细胞癌抗原Ⅰ与乙型肝炎病毒的结合受反应位点环域疏水性的影响

鳞片状细胞癌抗原Ⅰ (SCCA1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin)超家族的成员 ,具有多种变异体。有报道其中的两种(BP和AJ5 15 70 6 )能通过乙型肝炎病毒 (HBV)的前S1抗原促进表达SCCA1的细胞与HBV的结合。本研究从HepG2细胞中扩增出的一株SCCA1(A1)却不具备HBV结合能力。将A1的C末端与BP的C末端互换 ,获得的A1 BP能够结合HBV ,而BP A1却不能。A1与BP的C末端仅有 3个氨基酸的差异 ,其中 2个位于反应位点环域。一级结构分析发现在该区域内 ,A1的疏水性较弱 ,而BP和AJ5 15 70 6的疏水性较强。将A1的aa349位的弱疏水性的谷氨酸突变为强疏水性的缬氨酸 ,则可获得HBV结合能力。反之 ,将BP同一位点的缬氨酸突变为谷氨酸 ,则会丧失HBV结合能力。这些结果提示SCCA1与HBV的结合受反应位点环域的疏水性的影响

抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达

通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3 1/Hygro和pcDNA3 1(+)质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞。RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Westernblot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用。8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础

杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

研究已证实杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞 ,这提示了可将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。利用已构建的重组杆状病毒BacV CMV EGFPA ,以含病毒的Sf9细胞培养上清同时孵育多种哺乳动物细胞 ,利用流式细胞术检测报告基因在不同细胞株中的转移效率及表达效率。共使用了 2 0种哺乳动物细胞株 ,其中有 12种人类组织细胞 ,7种小鼠组织细胞 ,1种猴组织细胞。实验结果显示携带CMV启动子的重组杆状病毒可有效进入多数哺乳动物细胞 ,其中对人、猴来源细胞的基因转移效率显著高于对鼠源细胞 ,对贴壁细胞的基因转移效率显著高于对悬浮细胞。同时 ,通过脂质体LipofectAMINE将携带有CMV启动子和EGFP基因的哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3 1 EGFP分别转染部分特别是被认为杆状病毒进入能力较低的细胞株 ,结果显示CMV启动子在这些细胞中均可有效引导EGFP基因的表达 ,因此认为携带了CMV启动子的重组杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移效率能基本反映出杆状病毒对不同种哺乳动物细胞的进入能力。通过综合比较携带CMV启动子的杆状病毒对不同种属及组织来源细胞的基因转移及表达效率 ,可看出杆状病毒对灵长类动物贴壁细胞的基因转移及表达效果是较好的 ,而对小鼠来源的细胞及悬浮培养细胞却并不十分

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞 ,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因 ,利用Bac to Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达 ,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用 ,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度 ,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时 ,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染 4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示 ,将带毒Sf9细胞培养上清 (1.2× 10 7PFU mL)用哺乳动物细胞培养基 1倍稀释后 ,37℃下孵育靶细胞 12h(moi=5 0 ) ,可达到较高的基因转移及表达效率 ,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较 ,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为

应用离心方法提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导实验效率

重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体已获得了日益广泛的应用。为进一步提高转导实验的效率,本研究利用已构建的带有CMV启动子-增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达盒的重组杆状病毒BacV-CMV-EGFPA,在CV-1细胞中探索了应用离心方法提高转导实验效率的可行性。结果显示离心方法可显著提高单位时间内重组杆状病毒对哺乳动物细胞的转导效率,同时不会对靶细胞造成损伤。通过对离心时间、离心后孵育时间、病毒上清的稀释缓冲液的进一步摸索优化,结果显示病毒上清以PBS为稀释缓冲环境室温600g水平离心1h即可获得高水平的转导效率,优于在PBS环境中27℃孵育8h的效果。该方法可在获得高转导效率的同时显著缩短实验时间,具有快捷、高效、低损伤的特点,可作为一种常规操作方法用于日常实验。本研究进一步应用该方法对多种不同来源和类型的哺乳动物细胞株进行基因转导,结果显示该方法可适用于多数不同种属和组织来源的哺乳动物细胞,其中对贴壁细胞的效果最为显著

一种可药物筛选及体内检测的新型慢病毒基因治疗载体的构建

为实现基因治疗过程中的有效药物筛选及体内检测,首次利用核糖体内部进入位点(IRES)构建了同时携带O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(MGMT)的突变型P140K基因和荧光素酶(Luciferase)基因的慢病毒载体pBobi-MIL。RT-PCR、免疫荧光、药物筛选克隆形成及化学发光检测等实验结果表明感染重组慢病毒L-MIL的细胞能同时表达MGMT及Luciferase。构建成功的新型慢病毒载体为今后的基因治疗奠定了基础,也为慢病毒滴度的确定提供了一种新的可能