不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响

无细胞蛋白表达系统由于能够有效表达膜蛋白等有毒性蛋白,因此近二十年受到了关注,其蛋白表达产率有了显著的提高。细胞抽提物活性的高低是无细胞蛋白表达系统高效运行的关键,若找到简单易行的活性评估方法,将大大降低成本及时间。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PDH）是糖代谢的戊糖磷酸途径中的关键调控酶,该酶可以被用来评估细胞抽提物的活性。以G-6-PDH的活性为指标对无细胞蛋白表达系统中的抽提物活性进行评价,并利用G-6-PDH活性评价体系对机械破碎、高压破碎以及超声破碎三种破碎方法进行了比较,得出了三种破碎方法的最佳破碎条件。机械破碎最佳破碎条件是5000r/min,用直径0.1 mm玻璃珠,破碎6次;高压破碎的最佳破碎压力为1 300bar;超声破碎最佳破碎条件是功率强度为总功率的60%,破碎30次。酶活性测定结果显示机械破碎和超声破碎得到的抽提物活性比高压破碎得到的抽提物活性略高

不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响

无细胞蛋白表达系统由于能够有效表达膜蛋白等有毒性蛋白,因此近二十年受到了关注,其蛋白表达产率有了显著的提高。细胞抽提物活性的高低是无细胞蛋白表达系统高效运行的关键,若找到简单易行的活性评估方法,将大大降低成本及时间。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PDH）是糖代谢的戊糖磷酸途径中的关键调控酶,该酶可以被用来评估细胞抽提物的活性。以G-6-PDH的活性为指标对无细胞蛋白表达系统中的抽提物活性进行评价,并利用G-6-PDH活性评价体系对机械破碎、高压破碎以及超声破碎三种破碎方法进行了比较,得出了三种破碎方法的最佳破碎条件。机械破碎最佳破碎条件是5000r/min,用直径0.1 mm玻璃珠,破碎6次;高压破碎的最佳破碎压力为1 300bar;超声破碎最佳破碎条件是功率强度为总功率的60%,破碎30次。酶活性测定结果显示机械破碎和超声破碎得到的抽提物活性比高压破碎得到的抽提物活性略高

枯草芽孢杆菌抗茵肽生物合成的研究进展

革兰氏阳性菌模式生物----枯草芽孢杆菌能分泌多种肽类及由肽类衍生的抗菌活性物质,按合成途径不同,可分为核糖体肽和非核糖体肽.其中,非核糖体肽分子量较小,一般为 3000Da以下,其生物合成是通过多功能复合酶系----非核糖体肽链合成酶来完成的,多发生在菌体生长停止之后; 而核糖体肽分子量较大,其合成多于菌体快速生长时期.非核糖体肽链合成酶和核糖体肽的合成及其调控均需基因参与,而这一系列基因就构成了各种抗茵肽生物合成的基因簇.对核糖体肽和非核糖体肽的生物合成及其相关调控机制进行了综

枯草芽孢杆菌抗茵肽生物合成的研究进展

革兰氏阳性菌模式生物----枯草芽孢杆菌能分泌多种肽类及由肽类衍生的抗菌活性物质,按合成途径不同,可分为核糖体肽和非核糖体肽.其中,非核糖体肽分子量较小,一般为 3000Da以下,其生物合成是通过多功能复合酶系----非核糖体肽链合成酶来完成的,多发生在菌体生长停止之后; 而核糖体肽分子量较大,其合成多于菌体快速生长时期.非核糖体肽链合成酶和核糖体肽的合成及其调控均需基因参与,而这一系列基因就构成了各种抗茵肽生物合成的基因簇.对核糖体肽和非核糖体肽的生物合成及其相关调控机制进行了综

Effects of DKPs on Gene Expression of the Antibacterial Substances in Bacillus amyloliquefaciens Q-426

目的:解淀粉芽孢杆菌Q-426在其生长过程中能够产生芬枯草菌素、依枯草菌素、枯草杆菌素等多种脂肽类抗菌物质。利用实时荧光定量PCR的方法考察细菌群体感应信号分子二酮哌嗪类化合物(diketopiperazines,DKPs)对脂肽类抗菌物质合成的调控作用。方法:当Q-426菌进入对数生长期中期,向发酵液中加入终浓度为5 mg/L的DKPs,并继续培养至48 h,并利用实时荧光定量PCR的方法进行抗菌物质mRNA表达水平的定量分析。结果:二酮哌嗪类化合物能够抑制抗菌活性物质相关基因的表达。 &nbsp

肽受体跨膜镶嵌的人工细胞膜的构建:细菌组氨酸蛋白激酶跨膜区多肽在合成肽脂囊泡上的镶嵌

选择agrI型金黄色葡萄球菌ATCC6538组氨酸蛋白激酶AgrC蛋白六个跨膜区中与跨膜信号转导过程最密切的一条肽链为受体,将此多肽采用超声法镶嵌到人工细胞膜上,采用透射电镜和原子力显微镜对其形态进行了分析,发现大部分囊泡及镶嵌体系的单个形态为均一球状,直径大小在50～200nm范围内.考察悬浮液pH、体系温度及浓度等因素对其稳定性的影响,发现在pH为7.0,温度不超过30℃,多肽和N^＋C5Ala2C16的物质的量之比为1∶100时,镶嵌体系的稳定性最强.同时,通过圆二色谱、差示扫描量热分析等手段对镶嵌模型进行表征,分析发现多肽分子能稳定地插入双层膜囊泡中,且能主动地插入形成镶嵌体系

机械损伤对富士苹果酶促褐变的影响

研究了富士苹果机械损伤后在5℃和18℃贮藏条件下对生理变化及酶活性的影响。结果表明,机械损伤后的果实相对电导率急剧增大、L＊值迅速下降、多酚含量逐渐降低、丙二醛（MDA）含量逐渐上升,果肉快速发生褐变。机械损伤提高了多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性,抑制了超氧化物歧化酶（SOD）的活性。随着贮藏时间的延长,除了PPO外,其它指标都呈现了上升、下降的反复过程,说明组织自身的保护酶系统对伤胁迫具有生理防御作用,而且在低温贮藏时酶活性较强而能有效地延缓果实的衰老

重组蛋白AgrC的表达纯化及人工超分子体系的构建

目的：克隆表达金黄色葡萄球菌agr系统的受体蛋白AgrC,构建人工超分子体系。方法：构建基因工程菌E.coli TOP10-pBAD-AgrC,对诱导条件进行优化,对蛋白的提取方法进行分析优化。表达产物使用Western blot鉴定,His-tag镍柱亲和层析纯化。使用肽脂质N＋C5Gly2C16为膜材料制备囊泡作为载体,将纯化后的蛋白在囊泡上镶嵌。结果：构建的基因工程菌在18℃,0.002%的阿拉伯糖浓度下具有最高的表达效率,以内膜形式存在的AgrC蛋白在表面活性剂BDH中溶解效率最佳。结论：成功诱导表达并纯化了重组蛋白AgrC,成功利用其构建了人工超分子体系

大肠杆菌细胞抽提物制备方案的简化与优化

无细胞蛋白表达系统是一种将目的蛋白在体外进行表达的新技术和新方法,已广泛应用到蛋白质组学、蛋白质结构和功能等领域的研究中。在无细胞蛋白表达系统中,细胞抽提物的制备是关键因素之一。通过对大肠杆菌细胞抽提物制备过程中离心速度、预孵化和透析等参数的考察,利用绿色荧光蛋白作为报告蛋白,可以得到一个细胞抽提物制备的简化方案。采用相对低的转速(12 000×g,10 min),简易空孵化即可制备出活性高的细胞抽提物,用于无细胞体系蛋白表达,其表达的绿色荧光蛋白产量为209μg/mL。与传统的大肠杆菌细胞抽提物S30相比较,新方案将使时间与成本节省62%,产量是传统方法的2.6倍,使无细胞蛋白表达技术的操作快速、高通量的优势更加明显