PEGylation of proteins assisted by

聚乙二醇修饰可有效地降低蛋白质药物的免疫原性，延长体内循环半衰期和改善药效学性质。然而，现有的聚乙二醇液相修饰反应存在反应可控性差和修饰产物分子量不均一的缺点。本文探索一种新型的聚乙二醇修饰蛋白质的反应过程固相修饰。其特点是将蛋白质吸附在固相介质上，然后加入修饰剂与蛋白质进行反应。由于介质和蛋白质的相互作用以及空间位阻效应，可以在修饰过程中减少修饰反应的随机性以及提高反应的可控性。 首先，本论文使用离子交换介质对三种不同结构和性质的蛋白质进行固相介质辅助聚乙二醇修饰的研究，包括人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）、葡激酶（staphylokinase, SAK）和牛血红蛋白（bovine hemoglobin, bHb）。实验证明，使用聚乙二醇衍生物琥珀酰亚胺碳酸酯-单甲氧基聚乙二醇（SC-mPEG）以及离子交换介质进行固相介质辅助蛋白质的修饰反应，可以提高反应的可控性和单一组分修饰产物的比例，能够较好地保持蛋白质的活性。固相介质辅助聚乙二醇修饰以后，人血清白蛋白和葡激酶的聚乙二醇单修饰率分别达到45%和40%，高于普通液相修饰反应的修饰结果（单修饰率小于 30 %）；葡激酶的活性保持率可达65%，高于常规的液相修饰反应的活性保持率（30%左右）。 为了研究在固相介质辅助聚乙二醇修饰蛋白质的过程中修饰反应与分离纯化集成的可行性，本论文进一步研究了离子交换介质辅助聚乙二醇修饰牛血红蛋白的过程。 蛋白质经过聚乙二醇修饰后等电点会有所变化，牛血红蛋白的等电点（pI=7.2）与其反应条件的pH值（pH=6.8）比较接近，据此可通过选择合适的修饰条件，使修饰和未修饰的血红蛋白在层析的过程中彼此分离。在本实验中，牛血红蛋白的聚乙二醇单修饰产物的产率可达到70%左右。分子量为5 kD、10 kD、20 kD的聚乙二醇衍生物修饰牛血红蛋白产物的P50值分别为19.97 mm Hg、20.23 mm Hg、20.54 mm Hg；Hill系数分别为1.98、1.85、1.92；高铁氧化血红蛋白（MetHb） 的含量分别为15.41%、14.23%、13.75%，单修饰率和活性保持率都高于常规的液相反应。 另一方面，由于离子交换介质的吸附是非特异性的，所以离子交换介质辅助聚乙二醇修饰蛋白质不可避免的具有一定局限性。为此，本论文对共价层析介质辅助聚乙二醇修饰蛋白质做了初步探索，蛋白质上的巯基可以特异性地与共价介质上的巯基发生交联，具有一定的位置选择性。在本实验中，牛血红蛋白单修饰产物的产率为55%、P50值为22.13 mm Hg、Hill系数为2.18、高铁氧化血红蛋白（MetHb）的含量为7.2%。该结果表明，特异性共价介质辅助聚乙二醇修饰蛋白质的方法对于血红蛋白活性的保持具有更大的优势。 综上所述，使用固相介质辅助聚乙二醇修饰蛋白质的方法可提高修饰反应的可控性和聚乙二醇单修饰产物的产率，并能较好地保持蛋白质的生物活性。而且，通过选择合适的修饰条件，可实现蛋白质的修饰和分离纯化的集成。为制备单一组成的聚乙二醇修饰产物提供了一种新型有效方法

血红蛋白在膜分离过程中的氧化规律和抗氧化探索

脱离了红细胞的血红蛋白（Hb）在溶液中易被氧化成高铁血红蛋白（MetHb）,失去载氧活性.实验发现,当对红细胞裂解液进行微孔膜分离时,高铁血红蛋白增加不多;但在用层析法去除超氧化物歧化酶等其他红细胞蛋白后再进行超滤膜浓缩血红蛋白时,则出现较多的血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白的现象,其氧化反应随超滤过程膜表面流体切向速度的增加而加快,随溶液温度的增加而加快抗氧化剂的存在能有效地降低高铁血红蛋白的生成,谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、抗坏血酸（Vc）在溶液中和超滤过程中都能起到对血红蛋白载氧活性的保护作用其中Vc的效果最好,最适加入量（摩尔比）Vc/Hb=8,pH 8.将抗氧化的优化条件整合到从红细胞裂解液开始到超滤浓缩血红蛋白的整个流程,在离子交换层析后,添加Vc作为抗氧化剂进行超滤浓缩,Hb活性得到了很好的保护,MetHb的含量控制在2.3%,成功地制备了低MetHb含量的纯化血红蛋白

血红蛋白在膜分离过程中的氧化规律和抗氧化探索

脱离了红细胞的血红蛋白（Hb）在溶液中易被氧化成高铁血红蛋白（MetHb）,失去载氧活性.实验发现,当对红细胞裂解液进行微孔膜分离时,高铁血红蛋白增加不多;但在用层析法去除超氧化物歧化酶等其他红细胞蛋白后再进行超滤膜浓缩血红蛋白时,则出现较多的血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白的现象,其氧化反应随超滤过程膜表面流体切向速度的增加而加快,随溶液温度的增加而加快抗氧化剂的存在能有效地降低高铁血红蛋白的生成,谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、抗坏血酸（Vc）在溶液中和超滤过程中都能起到对血红蛋白载氧活性的保护作用其中Vc的效果最好,最适加入量（摩尔比）Vc/Hb=8,pH 8.将抗氧化的优化条件整合到从红细胞裂解液开始到超滤浓缩血红蛋白的整个流程,在离子交换层析后,添加Vc作为抗氧化剂进行超滤浓缩,Hb活性得到了很好的保护,MetHb的含量控制在2.3%,成功地制备了低MetHb含量的纯化血红蛋白

血红蛋白在膜分离过程中的氧化规律和抗氧化探索

脱离了红细胞的血红蛋白(Hb)在溶液中易被氧化成高铁血红蛋白(MetHb),失去载氧活性.实验发现,当对红细胞裂解液进行微孔膜分离时,高铁血红蛋白增加不多;但在用层析法去除超氧化物歧化酶等其他红细胞蛋白后再进行超滤膜浓缩血红蛋白时,则出现较多的血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白的现象,其氧化反应随超滤过程膜表面流体切向速度的增加而加快,随溶液温度的增加而加快.抗氧化剂的存在能有效地降低高铁血红蛋白的生成,谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、抗坏血酸(Vc)在溶液中和超滤过程中都能起到对血红蛋白载氧活性的保护作用.其中Vc的效果最好,最适加入量(摩尔比)Vc/Hb=8,pH8.将抗氧化的优化条件整合到从红细胞裂解液开始到超滤浓缩血红蛋白的整个流程,在离子交换层析后,添加Vc作为抗氧化剂进行超滤浓缩,Hb活性得到了很好的保护,MetHb的含量控制在2.3%,成功地制备了低MetHb含量的纯化血红蛋白

血红蛋白与人血清白蛋白偶联物作为血液代用品的大鼠换血试验研究

目的考察以血红蛋白与人血清白蛋白偶联物(Hb-HSA)及其他复苏液为大鼠换血后,大鼠血压变化及其长期存活率情况,研究此新型血液代用品的有效性。方法采用大鼠30%和60%换血两种模型,在线监测动脉血压,对比用Hb-HSA偶联产品、无基质血红蛋白、5%HSA溶液、Ringer乳酸盐溶液和原血换血以及失血不补液后大鼠血压变化,考察14d内大鼠的存活情况。结果大鼠30%换血,以扩容剂HSA和乳酸盐换血后,大鼠最终平均动脉血压(MAP)略低于初始值,无基质血红蛋白使MAP有所升高,Hb-HSA偶联产品与原血回输类似,基本维持原MAP。无基质血红蛋白,Hb-HSA偶联物和原血回输组大鼠存活率达100%,高于其他扩容剂换血实验组。大鼠60%换血,无基质血红蛋白及扩容剂HSA和乳酸盐换血后大鼠MAP仍然较低,Hb-HSA偶联产品基本能够维持MAP,类似于原血回输的对照,只有Hb-HSA偶联物换血和原血回输的大鼠100%存活。结论Hb-HSA偶联物为大鼠换血未引起血压升高,30%和60%换血后存活率均达100%,明显优于其他对照,体现出本偶联物对于紧急输血是一种具有优势的血液代用品。30%换血大鼠模型能够较好的体现出MAP因换血引起的波动,相对更适合于研究不同复苏液对血压的影响

血红蛋白与人血清白蛋白偶联物作为血液代用品的大鼠换血试验研究

目的考察以血红蛋白与人血清白蛋白偶联物（Hb-HSA）及其他复苏液为大鼠换血后，大鼠血压变化及其长期存活率情况，研究此新型血液代用品的有效性。方法采用大鼠30％和60％换血两种模型，在线监测动脉血压，对比用Hb-HSA偶联产品、无基质血红蛋白、5％HSA溶液、Ringer乳酸盐溶液和原血换血以及失血不补液后大鼠血压变化，考察14d内大鼠的存活情况。结果大鼠30％换血，以扩容剂HSA和乳酸盐换血后，大鼠最终平均动脉血压（MAP）略低于初始值，无基质血红蛋白使MAP有所升高，胁HSA偶联产品与原血回输类似，基本维持原MAP。无基质血红蛋白，Hb-HSA偶联物和原血回输组大鼠存活率达100％，高于其他扩容剂换血实验组。大鼠60％换血，无基质血红蛋白及扩容剂HSA和乳酸盐换血后大鼠MAP仍然较低，Hb-HSA偶联产品基本能够维持MAP，类似于原血回输的对照，只有Hb-HSA偶联物换血和原血回输的大鼠100％存活。结论Hb-HSA偶联物为大鼠换血未引起血压升高，30％和60％换血后存活率均达100％，明显优于其他对照．体现出本偶联物对于紧急输血是一种具有优势的血液代用品。30％换血大鼠模型能够较好的体现出MAP因换血引起的波动，相对更适合于研究不同复苏液对血压的影响

血红蛋白与人血清白蛋白偶联物作为血液代用品的大鼠换血试验研究

目的考察以血红蛋白与人血清白蛋白偶联物（Hb-HSA）及其他复苏液为大鼠换血后，大鼠血压变化及其长期存活率情况，研究此新型血液代用品的有效性。方法采用大鼠30％和60％换血两种模型，在线监测动脉血压，对比用Hb-HSA偶联产品、无基质血红蛋白、5％HSA溶液、Ringer乳酸盐溶液和原血换血以及失血不补液后大鼠血压变化，考察14d内大鼠的存活情况。结果大鼠30％换血，以扩容剂HSA和乳酸盐换血后，大鼠最终平均动脉血压（MAP）略低于初始值，无基质血红蛋白使MAP有所升高，胁HSA偶联产品与原血回输类似，基本维持原MAP。无基质血红蛋白，Hb-HSA偶联物和原血回输组大鼠存活率达100％，高于其他扩容剂换血实验组。大鼠60％换血，无基质血红蛋白及扩容剂HSA和乳酸盐换血后大鼠MAP仍然较低，Hb-HSA偶联产品基本能够维持MAP，类似于原血回输的对照，只有Hb-HSA偶联物换血和原血回输的大鼠100％存活。结论Hb-HSA偶联物为大鼠换血未引起血压升高，30％和60％换血后存活率均达100％，明显优于其他对照．体现出本偶联物对于紧急输血是一种具有优势的血液代用品。30％换血大鼠模型能够较好的体现出MAP因换血引起的波动，相对更适合于研究不同复苏液对血压的影响