基于调控脑肠轴探索解毒化瘀汤改善阿尔茨海默病小鼠认知功能的机制

目的研究解毒化瘀汤(黄连解毒汤加味方)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠学习、记忆障碍的影响及调控机制。方法侧脑室定位注射寡聚化Aβ42制备AD小鼠模型,灌胃给予黄连解毒汤、低剂量或高剂量解毒化瘀汤3周,多奈哌齐灌胃作为阳性对照。3周后,水迷宫、T迷宫、Y迷宫等检测小鼠学习、记忆功能;超高效液相色谱质谱联用(UPLC-Q-TOF/MS)分析比较黄连解毒汤原方和解毒化瘀汤的化学成分组成;飞行时间质谱联用技术(GC-TOF/MS)检测不同组别小鼠海马代谢物质的变化;16S rDNA检测不同组别小鼠肠道菌群多样性变化;Western印迹和免疫组化等手段检测信号通路表达变化。结果相较黄连解毒汤组,高剂量解毒化瘀汤显著改善了AD模型小鼠的学习、记忆障碍。UPLC-Q-TOF/MS结果显示,与黄连解毒汤相比,在解毒化瘀汤中,谷氨酸和天冬氨酸等氨基酸含量更丰富。分子生物学结果提示,解毒化瘀汤上调了AD模型小鼠海马NMDA受体亚基(NR1,NR2A和NR2B)的表达。基于GC-TOF/MS的代谢组学检测结果表明,相较黄连解毒汤,解毒化瘀汤显著提高了AD模型小鼠海马的腺苷水平。结合分子生物学,解毒化瘀汤同时也上调了腺苷下游的ATPase/AMPK信号通路。16S rDNA肠道菌群检测结果表明,解毒化瘀汤调控了AD模型小鼠肠道Firmicutes,Bacteroidetes,Proteobacteria等菌属的多样性。通过对代谢组学和肠道菌群进行的相关性分析,最终鉴定出Dorea是响应解毒化瘀汤上调AD模型小鼠海马腺苷水平的肠道菌属。结论相较黄连解毒汤原方,解毒化瘀汤显著改善AD模型小鼠的学习、记忆障碍,通过调控NMDA/ATPase/AMPK信号通路上调AD模型小鼠海马腺苷和肠道Dorea菌属水平,重塑大脑和肠道的沟通。上述研究提示,解毒化瘀汤可能是治疗AD的新型有效药物。国家自然科学基金(81704130)广州市科技计划项目(201904010238)福建省自然科学基金(2017J05139)广东省自然科学基金(2017A030310643)广州医科大学科研启动经费(B185006002047

肝豆状核变性分子生物学研究

【目的】探讨中国人肝豆状核变性(WD)的分子发病机制和基因诊断的方法。【方法】应用基因工程技术对WD 进行了10 年的分子生物学研究。【结果】①WD 的基因定位研究:通过RFLP 及微卫星多态性分析, 应用两位点及多位点连 锁软件, 建立了中国人WD 基因在D13q14 .2 -3区域的精细遗传连锁图谱, 从而首次对中国人WD 基因进行了精确定位;②WD 基因突变研究:应用PCR-SSCP 及DNA 测序技术, 对39 个家系45 名WD 患者进行该致病基因的21 个外显子突变筛选, 发现 WD 基因5 号外显子存在新的T 插入突变, 并证实中国人WD 基因的突变热点为8 号外显子, 突变形式为Arg778Leu, 其频率 为22.8 %;③WD 的症状前诊断和杂合子检出:应用DNA 重组技术对79 个家系进行基因诊断, 成功地进行了WD 的症状前 诊断和杂合子检出, 并建立了WD 的基因筛选的PC R- Msp 1 酶切方法。【结论】中国人WD 基因定位与白种人基本相同, 但 基因突变热点不同, 其发病机制存在差异, 从而基因诊断的方法也不同

灵孢多糖对脂多糖诱导的原代多巴胺能神经元变性的保护作用

【目的】观察灵孢多糖对脂多糖诱导的原代多巴胺能神经元变性的保护作用。【方法】建立原代中脑多巴胺能神经元与胶质细胞的共培养，随机分为6组：对照组、脂多糖组（20ng／mL）；单纯灵孢多糖组、脂多糖＋灵孢多糖（50，100，300μg／mL）3组。通过免疫组化检测酪氨酸羟化酶，OX-42的阳性细胞数，以RT-PCR检测TNF-α mRNA和iNOS mRNA表达。【结果】灵孢多糖（100，300μg/mL）组的酪氨酸羟化酶阳性细胞数明显多于脂多糖组，分别为（30．1±3．1，34．2±3．2，23．4±2．8）。脂多糖组激活的小胶质细胞体积增大，细胞数量增多（30．6±4．5），TNF-α mRNA和iNOS mRNA表达增高，但经较大剂量灵孢多糖（100，300μg／mL）预处理后，小胶质细胞的激活被抑制，总的细胞数量显著减少（26．4±5．1，25．1±4．6），TNF-α mRNA和iNOS mRNA表达量降低（P〈0．01）。【结论】灵孢多糖预处理对脂多糖诱导的原代中脑多巴胺能神经元变性具有保护作用，可能是由于灵孢多糖的预处理阻断了由脂多糖诱导的小胶质细胞的激活，从而减少了TNF-α mBNA和iNOS mRNA的表达

肝豆状核变性 8 号 14 号外显子基因突变的检测

目的: 筛选中国人肝豆状核变性的高频突变点。方法: 对中国人肝豆状核变性 39 个家系 45 个患者的 8 号、14 号外显子进行 PCR-SSCP 筛选,对有异常者进行序列分析(放射自显影) , 并通过该突变点的酶切再次筛选。结果: Exon 8 发 现有 3个泳动异常,两个为多态现象, 对 1 例明显异常者序列分析表明: ①患者的序列发现同义突变 C2250※G , 错义突变 G2273 ※T 发生 Arg778 Leu,引起功能缺失。患者上述两个突变同时存在。②患者父亲在 2250 位点 C 及 G 碱基同时存在, 在 2273 位点 G 及 T 碱基同时存在。 ③发现患者为纯合子, 其父为杂合子,母亲为正常序列。针对 Arg778 Leu 突变在所有病人中进 行酶切,发现 2 例纯合子占病人总数 4. 4%,11例杂合子占 24. 4%。酶切的阳性率为 28. 8%。结论: 本结果支持 8 号外显子 778 密码子作为中国人肝豆状核变性的高频突变点。本研究中出现类似杂合性丢失( LOH)现象, 提示 LOH 现象可能发生在 除肿瘤之外的其他遗传疾病中。Exon 14 未见异常,与欧洲人明显不同

灵孢多糖对MPP^＋损伤PC12细胞的保护作用

【目的】观察灵孢多糖（GLPS）对甲基-苯基-吡啶离子（MPP^＋）诱导损伤的PCI2细胞的保护作用。【方法】将MPP＋或GLPS加入体外培养的PCI2细胞中，建立多巴胺能神经元损伤模型，用四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞活力的变化；以乳酸脱氢酶（LDH）检测法检测培养上清液中LDH水平的改变；通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学法检测TH阳性细胞数及蛋白的表达。【结果】MPP^＋处理48h后，细胞活力降至对照组的52％，经GLPS（100、200、300μg／mL）预处理后，细胞活力明显提高。分别为65％，75％，79％（P〈0．05）。MPP^＋处理48h后．上清液中LDH水平较对照组明显提高．经不同浓度的GLPS预处理后．上清中LDH水平有所下降（P〈0．05），且TH阳性细胞数及表达强度明显高于MPP^＋组。【结论】灵孢多糖对MPP^＋诱导损伤的PCI2细胞具有保护作用