Novel ω-Transaminases for the Biocatalytic Production of Chiral Amines and Unatural Amino Acids

火焰燃烧合成法;苯;催化氧化;结构调控;催化

Construction of ethanologenic Escherichia coli and Cyanobacteria

本文致力于将运动发酵单胞菌产乙醇关键基因pdc 和adhB 构建至大肠杆菌和蓝藻PCC6803 及PCC7942 中，以获得能利用五碳糖和六碳糖产乙醇的大肠杆菌及光合产乙醇的工程蓝藻。 运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是目前乙醇发酵能力最强的细菌之一，是唯一利用ED 途径（Entner-Doudoroff Pathway）厌氧生产乙醇的微生物，具有将己糖高效转化为乙醇的酶系统。pdc 和adhB 是运动发酵单胞菌产乙醇途径的关键基因，分别编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，丙酮酸乙醛乙醇丙酮酸脱羧酶 乙醇脱氢酶 ，将添加有聚球藻PCC7942 的rbcLS 基因RBS 序列的pdc 和adhB 基因插入pUC18 载体，经双重菌液PCR 检验和酶切检验得到分别含有pUC-pdc、pUC-adhB 和pUC-adhB-pdc 载体的三个重组菌株；活性检测和摇瓶发酵实验表明，聚球藻PCC7942 的rbcLS 基因的RBS 序列能够有效介导运动发酵单胞菌的pdc 和adhB 基因在大肠杆菌中表达，重组大肠杆菌的产乙醇能力较出发菌株大幅提升。 乙醛指示平板法是用于定性检测产乙醇重组菌株的一种方法，被国内外研究者广泛使用。但是此方法也存在着一些缺点有待修正，如对希夫试剂的要求较高、易产生较强的背景色等。本研究对定性检测丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶表达菌株的方法做了改进，告别乙醛指示平板法，而是将菌液诱导表达，然后分别添加对应于两种酶的底物，让酶与底物反应0.5 至1 小时，之后再加希夫试剂进行显色反应，结果表明改进后的方法比乙醛指示平板法更加简便、快速、可靠。 高浓度的乙醇是一种对细胞有害的毒性物质。不论大肠杆菌、酵母、运动发酵单胞菌，还是蓝藻细胞，其对乙醇的耐受能力都是有一定限度的。而工业化酒精生产通常需要能够耐受较高乙醇浓度的菌株，所以未来的产乙醇蓝藻也必须具有较高的乙醇耐受能力。目前，研究者对乙醇耐受性及耐受机理的研究主要集中在酵母上，而关于蓝藻的乙醇耐受性的研究则几乎没有。鉴于此，本研究进行了PCC6803 和PCC7942 的乙醇耐受试验，从藻液色泽、细胞状态等方面初步研究了不同乙醇浓度对PCC6803 和PCC7942的影响，以期为蓝藻乙醇耐性的深入研究提供有价值的参考资料。 蓝藻是一种光合自养的原核生物，能够将大气中的CO2高效固定转化为糖类等有机物，而且其代谢中间物中含丙酮酸这一重要有机酸，因此有可能通过引入运动发酵单胞菌的pdc-adhB基因组合将一部分丙酮酸转化为乙醇，使蓝藻将光合固碳和产乙醇偶联起来，从而在蓝藻中构建起一条绿色的光合产乙醇途径。也就是说，将蓝藻原有的光合作用-碳固定-糖代谢网络进行延伸，在其丙酮酸位点嫁接上一条丙酮酸-乙醇途径，从而实现CO2向乙醇的绿色转化。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶能够将PEP转化为草酰乙酸而使转化为丙酮酸的PEP大大减少，所以敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因能够使PEP大量流入丙酮酸合成途径而有效增加丙酮酸的产量。为了将蓝藻细胞改造成能够以CO2为原料进行光合产乙醇的细胞工厂， 本研究构建了pUC-6803ppcUP-rbcLS-adhB-pdc-SmR-6803ppcDOWN 和pUC-7942ppcUP-rbcLS-adhB-pdc-SmR-7942ppcDOWN等共6 个同源整合载体，将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc作为整合位点，并尝试用自然转化的方法分别对集胞藻PCC6803 和聚球藻PCC7942 进行遗传改造。敲除竞争途径（ppc基因），增多胞内用于乙醇合成途径的有机碳源供应量，这为蓝藻生物乙醇的遗传改造开拓了思路。截至现在，转化筛选工作仍在继续进行

Transformation of phosphiothrici resistance gene(bar)in Undaria pinnatifida gametophytes

裙带菜(Undaria pinnatifida)配子体经2.5 L气升式光生物反应器快速营养增殖,通过基因枪法将携带草丁膦抗性基因(bar)的载体转入扩增后的配子体,经草丁膦筛选,获得抗性克隆。提取抗性克隆配子体基因组总DNA,经PCR和PCR Southern检测,结果显示60%的抗性克隆可检出bar基因,表明bar基因是裙带菜配子体基因工程有效的筛选标记。 &nbsp

微藻生物柴油技术的研究现状及展望

微藻生物柴油是一种优良的可再生新能源,对于解决人类面临的能源短缺和全球变暖两大危机具有潜在的重大战略意义。综述了微藻生物柴油的技术流程、油脂含量较高的微藻藻种、微藻生物柴油的最大技术瓶颈、提高微藻油脂总产量的方法、微藻的大规模培养、微藻的采收和微藻生物柴油的制取等方面的研究现状,并对微藻生物柴油未来的核心研究方向提出了初步见解。

Construction of Alcohol-producing Escherichia coli strains and Improvement of Biological Activity Detection Method for the Engineered Strains

adhB和pdc是运动发酵单胞菌产乙醇途径的关键基因,分别编码乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶,将添加有聚球藻PCC7942rbcLS基因RBS序列的adhB和pdc基因插入pUC18载体,经双重菌液PCR检验和酶切检验得到分别含有pUC-adhB、pUC-pdc和pUC-adhB-pdc载体的3个重组菌株。活性检测实验表明聚球藻PCC7942的rbcLS基因的RBS序列能有效介导运动发酵单胞菌的adhB和pdc基因在大肠杆菌中表达,摇瓶发酵实验表明重组大肠杆菌的产乙醇能力较出发菌株大幅提升。鉴于乙醛指示平板法存在着对希夫试剂的要求较高、易产生较强的背景色等缺点,对定性检测丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶表达菌株的方法做了改进,即:将菌液诱导表达,然后分别添加对应于两种酶的底物,让酶与底物反应0.5至1小时,之后再加希夫试剂进行显色反应,结果表明改进后的方法比乙醛指示平板法更加简便、快速、可靠。 &nbsp