PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND DEVELOPMENT OF DNA PROBES OF SCLEROTIUM ROLFSII SACC

收集之白絹病菌菌株,最佳的生長溫度為28-32C,在28C以下或32C以上皆不 利其菌絲生長;相對溼度100%時為菌絲最佳生長條件.菌核可在含有葡萄 糖,果糖,麥芽糖及蔗糖的培養基中發芽生長,而於含有乳糖,可溶性澱粉 ,半乳糖及纖維素培養基中,則不利於菌核發芽生長.在各種氮.菌絲生長之 素源之探討上,當培養基內含有亞硝酸鈉時,白絹病菌之菌核無法發芽生長 情形，各菌株在缺硝酸銨，硫酸鎂，硫酸鋅時，會抑制白絹病菌菌絲生長 ，而缺其他之元素磷酸鉀，亞磷酸鉀，氯化鐵，硫酸銅，硫酸錳時，對白 絹病菌菌絲生長之影響略小．在菌核，形成型方面，大致可分為A 型者 有 15株，R 型者有7 株，非A 非R 之中間型者有28株．以氯化銫梯度離 心法（CsCl-bisbenzimide density gradient centrifugation） ， 由總量DNA(total DNA)中萃取出粒腺體核酸(mtDNA)及核仁核酸（nDNA ），藉由內限制酵素EcoR 將其切成不同大小片段，經選殖於質體 pBlue -script(SK+)中,並轉形於Escherichia coli DH5■內,以獲得具有 崁入DNA重組質體(recombinant plasmid)之轉形菌株(transformants).自 菌株8040 02經轉形作用後,得到103個白色大腸桿菌轉形株;而自菌 株804021經轉形作用後,得到80個白色大腸桿菌轉形株.這些轉型株經過微 量質體抽取 (alkaline lysis),內限制酵素EcoR 酵解及電泳分析後,確定 其所攜帶之質體為帶有外來DNA片段之重組質體(recombinant plasmid). 以此mtDNA片段依其大小可將重組質體分為三群;大於2.96kb,小於2.96至1 kb之間及小於 1kb三群,在小於2.96kb至1kb之間及小於1kb二群中,篩選重 組質體804002 -69(0.53kb), 804002-14(0.45kb), 804002-96(1.1kb), 804002-28(1.8kb); 804021-43(0,48kb), 804021-67(0.8kb), 804021-53(1.3kb), 804021-29 (1.15kb)和Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum及Rhizoc- tonia solani之全DNA進行點雜配( dot hybridization) 反應.結果以 804021-53之雜合反應顯示此探針與大 部份Sclerotium rolfsii 之全DNA具有親合性.在此八個粒腺體DNA片段之 大小與限制圖譜皆不具相似性.利用探針804021-53以點雜配法進行敏感性 測定時,可有效偵測到菌株804027全DNA濃度至,偵測探針804021-53粒腺體 核酸片段時有效濃度為. 探針804021-53以點雜配法進行百合種球(白雪 內,外鱗片;白狐狸內,外鱗片以及白雪,白狐狸種球外土壤萃取液)組織敏 感性測定時,偵測有效濃度各為 , , ,

Application of modern biotechnology on the detection and diagnosis of plant pathogenic fungi

植物檢疫與植物防疫是未來植物保護的工作重點之一。而植物病原真菌之偵測鑑定與診斷技術將是植物檢疫與植物防疫的工作一環“免疫技術(immunologica1 techniques)及核酸技術(nuc1eic acid techniques)進行植物病原真菌偵測、診斷與鑑定為一較新技術“血清技術常利用的方法計以多株抗體、單株抗體為反應基質進行偵測(polyclonal and monoclonal antibodies as reagents)、酵素連結免疫吸附測定分析法(enzyme-linked immunosorbent assay)、免疫螢光及免疫金蛋白標識測定分析（imrnunof-lorescence and immunogold labeling)、核酸技術包括核酸探針(nucleic acid probes)製作，及以偵測診斷為主之核酸探針雜合反應(nucleic acid hybridization based detection techniques)、點雜配分析(dot-blot hybridization assay)、限制酵素輿圖多型性分析(restriction fragment length polymorphisms analysis)、DNA聚合酵素連鎖反應增幅法( DNA polymerase chain reaction ）、任意引子DNA 聚合酵素連鎖反應增幅法(random amplified polymorphic DNA -RAPD)、去氧核醣核酸指紋分析法(DNA fingerprinting)等技術。近年來，由於為使形態相近的不同菌株（種），或同種不同亞種及生理小種的菌株能夠提供便利的鑑別技術，於是利用粒線體核酸之多複本(high copy number)特性與不同菌株問皆會有特殊的差異加以應用核酸限制酵素切割片段多型性(RFLP)分析種問及種內差異性及菌株之問粒線體核酸多型性及變異性，更進一步由粒線體核酸選殖技術篩選出與田間菌株皆可產生交互作用的專一性核酸探針，以期能應用在田間病害之偵測“目前在菌株（種）快速鑑別與類緣關係的研究探討上，以任意引子DNA 聚合酵素連鎖反應技術(RAPD)及DNA 聚合酵素連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)為快速靈敏且可大量應用於實際偵測診斷應用上。目前為止，新技術之應用使植物病原真菌之偵測、診斷與鑑定進入了新里程碑，其實際應用層面及輔助分類鑑定診斷與偵測將是另一值得開發的新科技。 Plant quarantine Plays an important role in the development of plant protection. Detection and diagnosis of plant pathogenic fungi is one of the major work of plant quarantine. Immunological techniques and nucleic acid techniques have been remarkable progress in the development of new techniques for detection and diagnosis of plant pathogenic fungi. Immunological techniques include polyclonal and monoclonal antibodies as reagents, enzyme-linked immunosorbent assay, immunoflorescence and immunogold labeling, and nucleic acid techniques include nucleic acid hybridization based detection techniques, dot-blot hybridization assay, restriction fragment length polymorphisms analysis, DNA polymerase chain reaction, random amplified, DNA-RAPP, DNA fingerprinting. The last 5-10 years have been remarkable progress in the development of new techniques for convenient identification of different isolates of similar morphology and physiological races, by using polymorphisms and variation of mitochondrial DNA, and further cloning of specific DNA probes for the detection and diagnosis of plant pathogenic fungi. At present, random amplified polymorphic DNA and polymerase chain reaction are the most speedy and sensitive methods for practical application on the detection and diagnosis of plantpathogenic fungi. Since now, new biotechnology have been progress for the detection and diagnosis, and further development of new technology for the identification, diagnosis and detection of plant pathogenic fungi