第31回日本婦人科手術学会

学会開催報告2011年1月より全文公開

[学会開催報告] 第40回北陸産婦人科学会

[学会開催報告 /Reviews

第45回日本婦人科腫瘍学会学術集会

学会開催報告2011年1月より全文公開

婦人科癌における末梢血中腫瘍細胞からの遺伝子変異及びトランスクリプトームの解析

金沢大学医学系1、テロメラーゼ特異的増殖型GFP発現型アデノウイルスベクターを用いた末梢血中腫瘍細胞(CTC)の検出本法では感染させるウイルス濃度を上げるとがん細胞の感度は上昇するが白血球への非特異的ウイルス感染によるGFP発現の増加が避けられないという問題点があったが、白血球共通抗原CD45の標識を加えることで、GFP陽性かつCD45陰性細胞をCTCとして明確に区別できるようになった。この改良により特異度が高まると共にウイルス濃度を上げることが可能になり、検出感度も高くなり、システムの有効性がかなり向上した。また観察者の経験に左右されずに客観的にCTCを判定できるようになった。これらの検出方法を応用して、本学倫理委員会の承認ならびに被験者のインフォームドコンセントのもとに婦人科癌患者の血液を用いたCTC検出実験を行った。対象は子宮頚癌、子宮体癌、卵巣癌患者であり、30～50%程度の検体でCTCが検出された。CTCの消長は治療の効果と優位に相関しており、治療効果マーカーとなりうることが明らかになった。2、CTC単離方法の確立ナノリットル単位でのマニュピレーションが可能なPicoPipet^[○!R]にて蛍光顕微鏡下でのGFP陽性細胞の単離に成功した。子宮頸がん患者において回収されたCTCからHPV遺伝子の増幅に成功した。これは原発巣と同型のHPVであり確実に末梢血から腫瘍細胞を回収できていることを示す重要なデータであり、本法の有用性を示すものと考えられた。研究課題/領域番号:24390378, 研究期間(年度):2012出典：研究課題「婦人科癌における末梢血中腫瘍細胞からの遺伝子変異及びトランスクリプトームの解析」課題番号24390378（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-24390378/）を加工して作

女性ホルモン依存性がんに対するナノテクノロジー技術を用いた新しいDDSの開発

金沢大学医薬保健研究域医学系全身的な副作用を軽減した子宮内膜症に対する局所治療の開発を目的として、ヒアルロン酸を用いた薬剤送達システム(DDS)として、ダナゾール含有生体内分解性薬剤除放出ゲル(DZゲル)を考案した。作成したダナゾール(DZ)ゲルは、ヒアルロン酸にグルタリル基を導入することにより形成される微少な疎水性の腔にダナゾールが保持されている。DZゲルは病巣部のヒアルロニダーゼや活性酸素により分解され、内包されていたダナゾールが周囲組織に放出される。1%、1.5%、2%のヒアルロン酸ゲルは14日間でそれぞれ98%、73%59%のダナゾールを放出した。側鎖導入率を0.3としたDZゲルは14日間で97%のダナゾールを放出するが、0.6では48%のダナゾールを放出した。組織培養系の実験では、ラット子宮内膜上皮細胞を分離培養し、ダナゾールゲルの増殖抑制効果を検討した。10Mダナゾールで著明な抑制効果を認めた。動物実験系では、ラット子宮内膜症モデルを子宮内膜片をラット腹部皮下に自家移植することにより作成した。形成された子宮内膜嚢腫にDZを局所注入し、その病理組織像、体積変化、子宮内膜嚢腫組織中および血中ダナゾール濃度並びに性周期を検討した。DZゲルを投与した子宮内膜嚢腫の上皮細胞は投与しない嚢腫に比較して、細胞質の減少、核周囲の空胞化や核濃縮像を示した。PCNA抗体溶性細胞数は対照群3.7に対してDZ投与群では0.9で細胞死の著明な増加と増殖能の低下が認められた。子宮内膜嚢腫壁のダナゾール濃度は1週目で30μMと高値を示し、3週目でも6μMの濃度が維持された。一方、血漿中ダナゾール濃度は1週目で4ng/mlであったが、2週目以降は1ng/ml以下であった。子宮内膜嚢腫の体積変化は、DZゲル投与後9週間で約60%に縮小した。またDZゲル投与期間中の性周期は正常に保たれ、排卵数においても対照群との間に有意差を認めなかった。この結果から、DZゲルを用いたダナゾールの局所療法は、性周期を保った状況下で子宮内膜症の病巣を縮小させることが明らかとなった。研究課題/領域番号:17016027, 研究期間(年度):2005出典：「女性ホルモン依存性がんに対するナノテクノロジー技術を用いた新しいDDSの開発」研究成果報告書　課題番号17016027（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17016027/)を加工して作

婦人科癌におけるテロメラーゼをターゲットにした遺伝子治療

金沢大学医学部我々はこれまでにテロメレース活性が婦人科臓器由来の悪性腫瘍の90%以上で高いことや癌に特異的に発現しているテロメレース活性の癌のスクリーニング診断への応用は可能であることを子宮頸部擦過細胞診、尿細胞診、腹水細胞診などで報告してきた。特に、子宮頸部擦過細胞では細胞診にて偽陰性であった症例をテロメレース活性の検出により拾い上げることが可能で、両者の組み合わせにより診断精度が上昇することを明らかにした。また、テロメレース活性の定量法を開発し、癌と前癌病変、良性病変の鑑別診断に応用できることを報告した。さらに、癌のなかでも悪性度により活性が異なることから、予後予知因子としてまた追加治療の判断材料として臨床応用可能であることも示した。更に、遺伝子治療への応用も検討した。従来よりテロメレースは3つのサブユニット(hTR:human telomerase RNA,TPI:telomerase associated protein,hTERT:human telomerase reverse transcriptase)から構成されることが知られていたが、このうちどれが酵素活性の決定因子なのか不明であった。我々は、臨床材料を用いてhTERTが酵素活性を担う因子であることを明らかにした。さらに、hTERT遺伝子のプロモターのクローニングを世界に先駆け成功させた。hTERTプロモターの転写活性が癌細胞でのみ存在することが明らかとなったことより、アデノウイルスベクターにhTERTプロモターを導入し下流に治療遺伝子、例えば、P53などアポトーシス誘導遺伝子、を連結させ、がん細胞に効率良く発現させるベクターを開発した。これを用いた遺伝子治療を培養細胞や動物実験モデルで試みたところ、明らかな抗腫瘍効果が認められた。Human telomerase is composed of three main subunit components, human telomerase RNA (hTR), telomerase-associated protein (TP1) and telomerase reverse transcriptase (hTERT). RT-PCR analyses demonstrated that expression of hTERT was observed in cancer tissues and cell lines, while hTR or TP1 was broadly expressed not only in cancers but also in normal tissues. Thus, hTERT expression was well correlated with telomerase activity.We succeeded to clone promoter sequences of hTERT gene. Of particular importance is identification of transcription factors interacting with such regions and regulate hTERT express in utilizing it for gene therapy. C-Myc has been shown to be a direct transactivator of hTERT gene. Antisense strategy against c-Myc has been in success to inhibit telomerase activity in cancer cells and suppress the tumor growth. As another strategy, we have applied hTERT promoter to plasmid or virus vectors for gene therapy. We have constructed a chimeric vector in which hTERT promoter is cloned upstream of apoptosis-inducing genes inhibiting cell growth and introduced of these vectors into cervical cancer cells. We have confirmed the specific inhibition of tumor growth in cell lines and animal models by these gene therapies.研究課題/領域番号:09470354, 研究期間(年度):1997 – 1999出典：研究課題「婦人科癌におけるテロメラーゼをターゲットにした遺伝子治療 」課題番号09470354（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-09470354/094703541999kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

子宮体部の多段階発癌に関わる遺伝子群の解析とその遺伝子治療の検討

金沢大学医学部各種婦人科腫瘍について、多段階発癌に関与する遺伝子群、癌原遺伝子、癌抑制遺伝子群の変異を検索し、全症例の約80%にこれら遺伝子に何等かの変異が存在する事を明らかにした。即ち、Ras遺伝子の点突然変異は子宮体癌の前癌病変である異型増殖症で認められ、そのほとんどがk-rasコドン12、13の点突然変異で、すべてguanineからの変異であった。発癌過程における早期の変化であることが判明した。一方、癌抑制遺伝子のp53は異型増殖症には13例中1例(8%)と少なく、癌の進展に伴いGlで2/19(11%)、G2で1/7 (14%)、G3で6/14 (43%)と変異率は増加し、発癌過程での比較的晩期の変化であることが示唆された。突然変異の様式もすべてがguanineからの変化でコドン248に集中していることが判明した。他の癌抑制遺伝子DCCではD18S8における制限酵素Msp-IのRFLPを利用してLOHを検討したところ、1/7 (14%)に、m-RNAの低下は3/8例に認めた。Rb遺伝子のLOHも2/7 (29%)に、m-RNAの低下を1/7 (14%)に認めた。これらの多くは臨床進行期CIII期、あるいは未分化腺癌であった。さらに、人パピローマウイルス(HPV)がPCR法では6/47 (13%)に検出でき、約5%の子宮体部癌症例においてHPVゲノムが宿主DNAに組み込まれて存在することも明らかになった。ゲノムの不安定性やDNAミスマッチ修復遺伝子とくにhMSH-2の遺伝子異常についても約20%の症例に存在する事を明らかにした。以上をまとめると、子宮体癌におけるp53、K-ras、DCC, p16, RB遺伝子の異常やHPVの感染は高度分化型腺癌では17/26 (65%)、中程度分化型腺癌では5/7 (71%)、低分化型腺癌では12/13 (92%)に認められ、一部の症例では遺伝子異常が重複してみられた。しかし、単一遺伝子変異の率は前項で示すように低率であるため単一遺伝子をターゲットとする遺伝子治療は高率が悪いと考えられる。癌に普遍的に見られる変化として、不死化細胞のテロメア伸長に必要なテロメラーゼ活性の上昇が注目されている。我々も子宮体癌の90%近くにテロメラーゼ活性の上昇があることを突き止めた。この分子を標的とする遺伝子治療が有望であると考えられた。Recent advances in molecular biology have allowed us to study cancer at the level of individual genes. Such works have led to the theory of multistep carcinogenesis.The present study showed that activation of oncogenes, inactivation of tumor-suppresor genes, inactivation of mismatched-DNA repair genes and infection of human papillomavirus were closely involved in the carcinogenesis of uterine endometrium. Alterations of Ras, p53, DCC,P16, C-kit/SCF,RB were totally found in 17/26 (65%) G1 adenocarcinmas, 5/7 (71%) G2 adenocarcinomas and 12/13 (92%) G3 adenocarcinomas. However, the each abnormality of a single gene is quite low in its incidence.A frequent genetic change which takes place in carcinogenesis should be choosed as the target molecule of gene therapy. Our modified non-Rl TRAP (telomeric repeat amplification protocol) assay found that the telomerase activation was common (more than 90%) in endometrial cancer and was a critical step in their pathogenesis. Then, in the present time, the best target of gene therapy might be a telomerase molecule.研究課題/領域番号:06454473, 研究期間(年度):1994 – 1996出典：研究課題「子宮体部の多段階発癌に関わる遺伝子群の解析とその遺伝子治療の検討」課題番号06454473（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-06454473/064544731996kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作