Streptomyces clavuligerus proteomiği-optimizasyon

TÜBİTAK KBAG15.05.2015Streptomyces clavuligerus, sefamisin C antibiyotiği, bir beta laktamaz inhibitörü olan klavulanik asit ve anti-fungal ve antibakteriyel özelliğe sahip başka klavam bileşikleri üretmektedir. Bu metabolitlerin üretimi ve biyosentezi regülatör metabolizmaya bağlı kompleks regülatör moleküllerin etkileşimini gerektirmektedir (Liras vd., 2008). Streptomyces, dirençlilik, transport, biyosentetik enzimleri kodlayan genlere fiziksel olarak bağlı ya da onlar tarafından regüle edilen regülatör genleri içeren ve böylelikle antibiyoitk biyosentezini düzenleyen gen kümelerine sahiptir (Chater ve Bibb, 1997; Alexander ve Jensen, 1998). Proteomik analizler, Streptomyces’te daha önce karakterize edilmemiş hücresel dinamikleri ve bileşenleri açığa çıkarma potansiyeline sahiptir. Ayrıca proteomik yöntemler kullanılarak belirli koşullar altında ekspresyon seviyelerinde meydana gelen önemli değişimlerin 2D jel elektroforez yöntemi kullanılarak belirlenebileceği ve böylelikle istenen ikincil metabolitlerin üretiminin arttırılmasına yönelik organizmada değişiklikler yapılabileceği gibi (Chaudhary vd., 2013) Streptomyces’te antibiyotik üretimi ve ikincil metabolizma ile bağlantı gösteren morfolojik değişim mekanizmaları açığa çıkarılabilir (Zhou vd., 2011). S.clavuligerus türü için henüz belirlenmiş ve optimize edilmiş bir protein ekstraksiyon metodu ve 2D protein profili çıkarma yöntemi yoktur. Bu çalışmada 4 farklı protein ekstraksiyon yöntemi denenerek ve gerektiği durumlarda modifikasyonlar yapılarak, her ekstraksiyon için 2D jelleri hazırlanmış ve jeller birbirleriyle Delta2D programı ile karşılaştırılarak, protein miktarı ve yoğunluğu, ekstraksiyon yönteminin verimliliği açısından en uygun yöntem olan Fenol Ekstraksiyon yöntemi I (Faurobert vd., 2007) seçilmiştir. Böylelikle ileride yapılacak S.clavuligerus proteom çalışmalarımızın ilk ve en önemli basamağı için optimize bir yöntem belirlemiş bulunmaktayız.Streptomyces clavuligerus produces cephamycin C antibiotic, the β-lactamase inhibitor clavulanic acid, and several other clavam compounds that show antibacterial and antifungal activities. The production and biosynthesis of these metabolites requires the interplay of complex regulatory molecules linked to the regulatory metabolism (Liras vd., 2008). Streptomyces possess gene clusters that orchestrate the biosynthesis of these antibiotics, which include resistance, transport, regulatory genes physically linked and regulated with genes encoding biosynthetic enzymes (Chater and Bibb, 1997; Alexander and Jensen, 1998). Proteomic analyses have the potential to reveal previously uncharacterized components and dynamics in the cellular networks in streptomycetes. Furthermore, the mechanism of differentiation which is correlated with antibiotic production and secondary metabolism in streptomycetes can be understood by proteomics (Zhou et al., 2011) as much as significant changes in expression levels under certain conditions by using 2D gel electrophoresis can be detected and used for engineering the organisms for the increase of secondary metabolites of interest (Chaudhary et al., 2013). There has been no optimized procedure for the protein extraction from S. clavuligerus yet. In this study, 4 different protein extraction methods with the modifications on them if needed were used to prepare 2D gels and those gels were compared with each other by using Delta2D program with respect to their spot number, density and the efficiency of the extraction method so that Phenol Extraction Method I (Faurobert et al., 2007) was chosen as the most suitable protein extraction method, which is the first and the most important step for the S. clavuligerus proteomic studies that will be performed in the future