Non-viral siRNA and shRNA Delivery Systems in Cancer Therapy

RNA interference represents a promising therapeutic strategy for the silencing of specific target genes in cancer therapy. Small interfering RNAs and DNA-based vectors encoding short hairpin RNAs provide sequence-specific post-transcriptional gene silencing by binding to its complementary RNA. For the therapeutic use of siRNA in cancer, efficient intracellular delivery is necessary. The efficient cancer therapy with RNAi is not still accomplished because of internalization and intracellular trafficking problems such as low transfection efficiency, enzyme degradation, inappropriate subcellular localization, and endosomal trapping of siRNAs in cells. Cancer is a complex disease including multiple genes and pathways. The most important benefits of siRNA therapy are high target specificity and non-toxicity compared with chemotherapy. The uptake of siRNA by cells without a carrier system is possible, but naked siRNA is mostly degraded with nucleases and activates the immune responses. Development of appropriate delivery systems is an important issue in the use of siRNA-based therapeutics. Non-viral delivery systems have great potential for safe and effective delivery of siRNA therapeutics to tumor cells. Nanocarriers such as nanoplexes, lipoplexes, nanoparticles, and liposomes have been commonly used for siRNA delivery. This chapter highlights the importance of non-viral delivery systems in vitro and in vivo cancer therapy

siRNA’nın biyodağılımına kitozan komplekslerinin etkisi

Amaç: RNAi kanser dahil olmak üzere birçok hastalığın moleküler mekanizmasının analizinde ve gen susturulmasında hücresel proseslerin kontrolü için önemli bir araçtır. VEGF sinyali meme kanserinde siRNA taşınmasında önemli bir hedeftir. siRNA farklı hastalıklar için potansiyel bir ajan olmasına rağmen, siRNA’nın intrasellüler taşınması, terapötik olarak aktif bir moleküle dönüşmesindeki önemli engellerden biridir. Bugüne kadar birçok transfeksiyon yöntemi ve taşıyıcı sistem geliştirilmiştir. Bunlar arasında kitozan, biyouyumlu, biyoparçalanabilir olması, toksik ve immunojenik olmaması gibi özellikleri nedeniyle önemli bir gen taşıyıcısıdır. Bu çalışmanın amacı, meme kanserinde kitozan/VEGF-siRNA komplekslerinin tümör lokalizasyonunu ve biyodağılımını araştırmaktır. Yöntem: Çalışmamızda meme tümörü taşıyan sıçanlara serbest FITC-işaretli siVEGF (40 µg/sıçan) ve kitozan/ FITC-işaretli siVEGF (40 µg/sıçan) kompleksleri intravenöz olarak enjekte edildi. Bulgular: Kitozan/siVEGF komplekslerinin beyin ve kalbe biyodağılımı, serbest siVEGF ile hemen hemen benzerken, dalak, karaciğer, akciğer ve kasta biraz daha düşük ve böbrekte ise biraz daha yüksektir. Meme tümör dokusunda, kompleksler enjeksiyon sonrası 15 dakikada tümörde lokalize iken, serbest FITC-siVEGF tümör dokusunda lokalize değildir. Sonuç: Bu ön çalışmada, biz biyodağılım için VEGF siRNA taşıyıcı sistem olarak kitozanın umut verici olduğunu gösterdik

Kitozan esaslı taşıyıcı sistemler ile deriden gen transferinin araştırılması

KİTOZAN ESASLI TAŞIYICI SİSTEMLER İLE DERİDEN GEN TRANSFERİNİN ARAŞTIRILMASILokal ve sistemik ilaç uygulamaları için deri, vücudun en uygun organıdır. Bu çalışmada, kitozan-esaslı değişik farmasötik formlar, deriden DNA uygulaması için araştırılmıştır. Bu çalışmada DNA taşıyan 3 farmasötik şekil; kitozan hidrojel, nanopartikül, lipozom ve kitozan kaplı lipozom formülasyonları hazırlanmış, formülasyonların fiziko-kimyasal özellikleri, in vitro ve in vivo transfeksiyon etkinlikleri ayrıntılı olarak incelenmiştir. Her üç formun da DNA’yı kontrollü serbestleştirdiği, in vitro ve in vivo stabilitesini olumsuz yönde etkilemediği ve DNA’yı enzimatik etkilerden koruduğu saptanmıştır. Kontrolleri yapılan ve özellikleri belirlenen farmasötik şekiller, in vitro ve in vivo transfeksiyon çalışmalarında kullanılmıştır. İn vitro DNA transfeksiyon çalışmalarında, NIH 3T3 ve Swiss 3T3 fare fibroblast hücre kültürleri ve primer insan dermal fibroblast hücre kültürü kullanılmıştır. Formülasyonların, DNA transfeksiyon etkinlikleri, pSV-β-Gal plazmidi tarafından kodlanan β-galaktozidaz ekspresyonu ile saptanmıştır. İn vitro transfeksiyon çalışmalarında; en yüksek düzeyde transfeksiyon etkinliği ve gen ekspresyonu, lipozom formülasyonlarında gözlenmiştir. İn vitro transfeksiyon etkinliği açısından formülasyonların gen transferinde kullanılabilirliğinin, kitozan kaplı lipozom > lipozom > hidrojel > nanopartikül sıralamasına uygun sonuçlar verdiği belirlenmiştir. İn vivo DNA transfeksiyon çalışmalarında ise yavru ve genç erişkin Sprague-Dawley sıçanlar kullanılmıştır. Enzim testleri ve histolojik incelemeler sonucunda; gen ekspresyonunun, derinin dermis ve hipodermis tabakalarında 7 gün süresince devam ettiği saptanmıştır. İn vitro transfeksiyon çalışmalarından farklı olarak, in vivo transfeksiyon etkinliği açısından formülasyonların gen transferinde kullanılabilirliğinin, kitozan kaplı lipozom > lipozom > nanopartikül > hidrojel sıralamasına uygun sonuçlar verdiği belirlenmiştir.Sonuç olarak, kitozan-esaslı taşıyıcı sistemlerden olan kitozan hidrojel, kitozan nanopartikül ve lipozom ve kitozan kaplı lipozomlar ile etkin bir şekilde deriden gen transferi mümkündür. Elde edilen veriler, deriden gen transferi ve gen tedavisi çalışmaları için temel oluşturmaktadır. AN INVESTIGATION OF CHITOSAN-BASED CARRIERSFOR GENE TRANSFER THROUGH THE SKINThe skin is an attractive and the largest organ for local and systemic drug applications. In present study, chitosan-based pharmaceutical forms were investigated for nucleic acid delivery into the skin. In this study, three different pharmaceutical forms including chitosan hydrogels, nanoparticles, liposomes and chitosan-coated liposomes were prepared for gene delivery. Physico-chemical properties and in vitro / in vivo transfection characteristics of these formulations were investigated in detail. It was observed that all of three forms demonstrated controlled-release of DNA, had no negative effect on the stability of DNA and protected DNA from enzymatic degradation in in vitro and in vivo conditions. After the control and characterization of these forms, they were used for DNA transfection. Mouse fibroblastic NIH 3T3 and Swiss 3T3 cell lines and primary human dermal fibroblasts were used for in vitro DNA transfection experiments. Transfection efficiency of formulations was monitored by measuring of β-galactosidase activity expressed by β-Gal reporter plasmid. Among the pharmaceutical forms, the higher DNA-transfection efficiency and reporter gene expression was obtained with liposome formulations than that of other forms. From the point of DNA-transfection efficiency, the capability of different pharmaceutical forms were ordered as chitosan coated liposome > liposome > hydrogel > nanoparticle. Pups and young adult Sprague–Dawley rats were used for in vivo DNA-transfection studies. By using enzyme assays and histological techniques, it was shown that the reporter gene expression in dermis and hypodermis layers of skin sustained for 7 days. In contrast to in vitro results, for the in vivo counterpart the DNA-transfection efficiency of the forms were obtained as chitosan-coated liposome > liposome > nanoparticle > hydrogel.As a result, chitosan-based delivery systems including hydrogels, nanoparticles, chitosan coated liposomes and liposomes can be efficiently used for DNA transfer through the skin. These results will form the basis for gene delivery and gene therapy via the skin

Kitozan esaslı taşıyıcı sistemler ile deriden gen transferinin araştırılması

KİTOZAN ESASLI TAŞIYICI SİSTEMLER İLE DERİDEN GEN TRANSFERİNİN ARAŞTIRILMASI Lokal ve sistemik ilaç uygulamaları için deri, vücudun en uygun organıdır. Bu çalışmada, kitozan-esaslı değişik farmasötik formlar, deriden DNA uygulaması için araştırılmıştır. Bu çalışmada DNA taşıyan 3 farmasötik şekil; kitozan hidrojel, nanopartikül, lipozom ve kitozan kaplı lipozom formülasyonları hazırlanmış, formülasyonların fiziko-kimyasal özellikleri, in vitro ve in vivo transfeksiyon etkinlikleri ayrıntılı olarak incelenmiştir. Her üç formun da DNA’yı kontrollü serbestleştirdiği, in vitro ve in vivo stabilitesini olumsuz yönde etkilemediği ve DNA’yı enzimatik etkilerden koruduğu saptanmıştır. Kontrolleri yapılan ve özellikleri belirlenen farmasötik şekiller, in vitro ve in vivo transfeksiyon çalışmalarında kullanılmıştır. İn vitro DNA transfeksiyon çalışmalarında, NIH 3T3 ve Swiss 3T3 fare fibroblast hücre kültürleri ve primer insan dermal fibroblast hücre kültürü kullanılmıştır. Formülasyonların, DNA transfeksiyon etkinlikleri, pSV-β-Gal plazmidi tarafından kodlanan β-galaktozidaz ekspresyonu ile saptanmıştır. İn vitro transfeksiyon çalışmalarında; en yüksek düzeyde transfeksiyon etkinliği ve gen ekspresyonu, lipozom formülasyonlarında gözlenmiştir. İn vitro transfeksiyon etkinliği açısından formülasyonların gen transferinde kullanılabilirliğinin, kitozan kaplı lipozom > lipozom > hidrojel > nanopartikül sıralamasına uygun sonuçlar verdiği belirlenmiştir. İn vivo DNA transfeksiyon çalışmalarında ise yavru ve genç erişkin Sprague-Dawley sıçanlar kullanılmıştır. Enzim testleri ve histolojik incelemeler sonucunda; gen ekspresyonunun, derinin dermis ve hipodermis tabakalarında 7 gün süresince devam ettiği saptanmıştır. İn vitro transfeksiyon çalışmalarından farklı olarak, in vivo transfeksiyon etkinliği açısından formülasyonların gen transferinde kullanılabilirliğinin, kitozan kaplı lipozom > lipozom > nanopartikül > hidrojel sıralamasına uygun sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Sonuç olarak, kitozan-esaslı taşıyıcı sistemlerden olan kitozan hidrojel, kitozan nanopartikül ve lipozom ve kitozan kaplı lipozomlar ile etkin bir şekilde deriden gen transferi mümkündür. Elde edilen veriler, deriden gen transferi ve gen tedavisi çalışmaları için temel oluşturmaktadır. AN INVESTIGATION OF CHITOSAN-BASED CARRIERS FOR GENE TRANSFER THROUGH THE SKIN The skin is an attractive and the largest organ for local and systemic drug applications. In present study, chitosan-based pharmaceutical forms were investigated for nucleic acid delivery into the skin. In this study, three different pharmaceutical forms including chitosan hydrogels, nanoparticles, liposomes and chitosan-coated liposomes were prepared for gene delivery. Physico-chemical properties and in vitro / in vivo transfection characteristics of these formulations were investigated in detail. It was observed that all of three forms demonstrated controlled-release of DNA, had no negative effect on the stability of DNA and protected DNA from enzymatic degradation in in vitro and in vivo conditions. After the control and characterization of these forms, they were used for DNA transfection. Mouse fibroblastic NIH 3T3 and Swiss 3T3 cell lines and primary human dermal fibroblasts were used for in vitro DNA transfection experiments. Transfection efficiency of formulations was monitored by measuring of β-galactosidase activity expressed by β-Gal reporter plasmid. Among the pharmaceutical forms, the higher DNA-transfection efficiency and reporter gene expression was obtained with liposome formulations than that of other forms. From the point of DNA-transfection efficiency, the capability of different pharmaceutical forms were ordered as chitosan coated liposome > liposome > hydrogel > nanoparticle. Pups and young adult Sprague–Dawley rats were used for in vivo DNA-transfection studies. By using enzyme assays and histological techniques, it was shown that the reporter gene expression in dermis and hypodermis layers of skin sustained for 7 days. In contrast to in vitro results, for the in vivo counterpart the DNA-transfection efficiency of the forms were obtained as chitosan-coated liposome > liposome > nanoparticle > hydrogel. As a result, chitosan-based delivery systems including hydrogels, nanoparticles, chitosan coated liposomes and liposomes can be efficiently used for DNA transfer through the skin. These results will form the basis for gene delivery and gene therapy via the skin