[Prikaz apoptotičnih celic v tumorskih parafinskih rezinah]

Apoptosis is a distinct form of cell death characterised by specific morphological features and regulated by complex molecular mechanisms. Its deregulation is fundamental for tumour growth and progression and, moreover, anticancer therapies suppress tumour growth mainly by induction of apoptosis. Since the extent of apoptosis in a tumour may have prognostic as well as therapeutic implications, much effort has been invested in developing specificmethods that can be routinely used to detect apoptotic cells in archival formalin fixed paraffin-embedded tissue. Complex molecular pathways are involved in the regulation of apoptosis. Pro-apoptotic signals trigger activation of caspases that specifically cleave target proteins. Cleavage of proteins (caspase substrates) is responsible for morphological changes of apoptotic cells and DNA fragmentation. In the last decade, detection of apoptotic cells in formalin fixed tumour tissue sections has been based mainlyon morphology and characteristic DNA fragmentation. Recently, specific antibodies to activated caspases and cleaved target proteins (including cytokeratin 18, actin and PARP) have been produced that enable accurate detection of apoptosis in paraffin sections.Apoptoza je oblika celične smrti z značilnimi morfološkimi spremembami, ki jo uravnavajo zapleteni molekularni mehanizmi. Motnje v uravnavanju apoptoze so pomembne za rast tumorjev, hkrati pa različne metode zdravljenja tumorjev zavirajo njihovo rast pretežno s sprožanjem apoptoze tumorskih celic. Ugotavljanje apoptotske aktivnost v tumorju je lahko pomembno za napoved poteka bolezni in njenega zdravljenja, zato je pomemben razvoj metod za rutinski prikaz apoptotičnih celic v tumorskem tkivu, ki je bilo fiksirano v formalinu in vklopljeno v parafin. Pri uravnavanju apoptoze sodelujejo zapletene molekularne poti. Različni proapoptotični signali sprožijo aktivacijo kaspaz, slednje pa cepijo tarčne beljakovine. Njihova cepitev je odgovorna za morfološke spremembe apoptotičnih celic in značilno cepitev jedrne DNK. V zadnjem desetletju je prikaz apoptotičnih celic v tumorskem tkivu fiksiranem v formalinu temeljil pretežno na morfoloških značilnostih in značilni fragmentaciji DNK. V zadnjem času omogoča zanesljiv prikaz apoptotičnih celic imunohistokemična reakcija na prikaz aktiviranih kaspaz in cepljenih tarčnih beljakovin (citokeratin 18, aktin, PARP)

[Kvantitativna analiza vzorcev aspiracijske biopsije]

The fine needle aspiration biopsy (FNAB) is one of the methods used in tumour evaluation. Since a certain number of tumour cells are needed for a complete diagnostic algorithem, we wanted to test how many cells remain in the needle and syringe after routine stains have been made and which factors influence this number. The remaining cells are used in ancillary diagnostic procedures. Material and methods. One hundred fifty two FNAB samples of tumours of the breast, thyroid and lymph nodes were included in our study. We counted the cells which were left in the needle and the syringe after the standard smears had been made. Buerker-Tuerks chamber was used for this purpose. Results. The number of cells depended on the organ from which the cells had been aspirated,on the type of tumour and, in the case of breast cancer, also on thelevel of experience of the FNAB performer. The percentage of samples with too few cells for all modern diagnostic methods (<5x105) is lowest in FNAB of lymph nodes (4.9%), followed by breast (16.7%) and thyroid (18%). Conclusions.We concluded that FNAB in the majority of cases grants a sufficient number of cells for the standard microscopic evaluation and also ancillary diagnostic procedures.Izhodišča. Aspiracijska biopsija s tanko iglo (ABTI) je varna, hitra, enostavna, neboleča in poceni metoda v preoperativni diagnostiki tumorjev. Za postavitev diagnoze je potrebno z ABTI pridobiti določeno število celic za izdelavo rutinskih celičnih razmazov ter za dodatne, novejše preiskave, ki so pomembne za natančnejšo opredelitev prognostičnh dejavnikov in določitev ustreznega zdravljenja. Zanimalo nas je, koliko celic ostane v igli in brizgalki po pripravi rutinskih preparatov in kaj vpliva na to število, kajti ravno na tem delu vzorca opravljamo te dodatne preiskave. Material in metode. V prospektivno raziskavo smo vključili 152 vzorcev ABTI tumorjev dojke, ščitnice in bezgavke. S pomočjo Buerker-Tuerkove komore smo šteli celice, ki ostanejo v brizgalki in igli po pripravi rutinskih preparatov. Rezultati. Po ocenah sodelavcev Onkološkega inštituta je za dodatne preiskave potrebno z ABTI pridobiti vsaj 500.000 celic poleg tistih, ki smo jih uporabili za dva rutinska razmaza. To smo dosegli pri vzorcih 95% tumorjev bezgavk, 82% tumorjev ščitnice in 81% tumorjev dojk. Ugotovili smo, da je število celic odvisno od organa, ki ga punktiramo. Pri tumorjih dojk in bezgavk je število odvisno tudi od vrste tumorja, velikost tumorja pa na število celic ne vpliva.Ko smo primerjali število celic, ki so jih pridobili izkušeni citologi s številom pri manj izkušenih, smo pri ABTI tumorjev dojk dobili statistično značilno razliko (p=0,03), pri ostalih dveh pa razlika ni dosegla statistične značilnosti. Zaključki. ABTI je metoda, ki v večini primerov zagotovi zadostnoštevilo celic za standardno mikroskopsko preiskavo in dodatne anlize tumorskih celic. Število celic je odvisno od organa, ki ga punktiramo, lastnosti tumorja in pri ABTI dojke tudi od izvajalca

Elektropermeabilizacija celic z majhnimi molekulami in vitro

A systematic study concerning the role of the different electric field parameters (pulse number, duration and amplitude) on electropermeabilization of DC3F cells to small molecules (propidium iodide) and on cell viability is presented. Cell permeabilization and viability dependence on the pulse amplitude was determined by twenty different sets of electrical parameters. The number of pulses varied between 1 and 64 and pulse duration between 20 micros and 1 ms. The most important parameter was the pulse amplitude because at triggered the electropermeabilization process and the process of cell death. Either in the case of electropermeabilization as well as in the case ofcell viability experiments, the parameter Uso (the pulse amplitude leading to permeabilization or to the death of 50% of cell population) was not changedif the set of electrical parameters consisted of more than 16 pulses. This was independent of the pulse duration. The efficiency of permeabilizationwas enhanced by using of longer pulses. Such a systematic study of the influence of different electric field parameters on electropermeabilization and cell viability may serve as a base for optimization of the electropermeabilization conditions for different applications.V članku predstavljamo sistematično študijo vloge različnih električnih parametrov (število, trajanje in amplituda električnih pulzov) v procesu elektropermeabilizacije celic DC3F za majhne molekule in vpliva teh parametrovna preživetje celic. Permeabilizacijo celic in njihovo preživetje smo določili za dvajset različnih naborov električnih pulzov. Število električnih pulzov smo spreminjali od 1 do 64, njihovo trajanje pa med 20 mikros in 1 ms. Najpomembnejši električni parameter je amplituda električnih pulzov, saj sproži proces elektropermeabilizacije in proces umiranja celic. Tako v primeru elektropermeabilizacije celic kot tudi ob študiju celičnega preživetja smo ugotovili, da se parameter U5o (tj. amplituda električnih pulzov pri kateri je permeabiliziranih (ali mrtvih) 50% celic v populaciji) nespremeni, če uporabljeni vlak električnih pulzov sestavlja več kot 16 električnih pulzov. Ugotovitev je neodvisna od njihovega trajanja. Perrneabilizacija je učinkovitejša, če uporabimo daljše električne pulze. Takosistematično študijo vpliva električnih parametrov na elektropermeabilizacijo in preživetje celic lahko uparabimo kot osnovo za optimizacijo elektropermeabilizacijskih pogojev pri različnih aplikacijah elektropermeabilizacije

Protitumorsko delovanje bleomicina na SA-1 tumorjih po predhodni terapiji z vinblastinom

In our previous study, vinblastine (VLB) was shown to increase the plasma membrane fluidity. This effect of VLB might be exploited for better transport of drugs through the plasma membrane. The aim of the present study was to determine whether pretreatment with VLB can increase the cytotoxic effect of BLM on intraperitoneal SA-1 tumors in mice. Materials and methods. BLM and VLBwere used as single agents or in various combinations, i.e. BLM injected 24h before VLB or vice-versa, VLB injected 24 h before BLM. Cell and animal survival together with DNA histograms were the end-points used to determine the effect of these combined treatments. Results. Both drugs, either as singletreatment or in different combined therapy schedules reduced significantly the number of cells in peritoneal lavage, compared to control, saline treated animals. The combination of VLB, followed by BLM after 24 h reduced significantly the number of cells in peritoneal lavage, compared to the treatment in which BLM was followed by VLB or to the treatment with singledrugs alone. Median survival time of mice treated with VLB alone, BLM alone and combination of both drugs was significantly prolonged compared to the control untreated mice. When VLB and BLM were combined, both treatment combinations were more effective than monochemotherapies with VLB or BLM. The best results were obtained when VLB was followed by BLM after 24 h. The DNA histogram of cells treated with VLB showed a decreased number of cells in S phase and an increased number of cells with DNA values greater than in G2M compartment compared to the control untreated cells. BLM in the dosage used inthese experiments did not affect the progression of cells through cell cycle. Both combinations of VLB and BLM produced similar cell kinetic effect as VLB alone. Conclusion. (Abstract truncated at 2000 characters.)Izhodišča. V naši predhodni študiji smo ugotovili, da vinblastin (VLB) poveča fluidnost plazmaleme, kar bi lahko izkoristili za povečan transport zdravil preko plazmaleme. Namen naše raziskave je bil na mišjih intraperitonealnih tumorjih določiti, ali se poveča učinkovitost bleomicina (BLM) po predhodni terapiji z VLB. Materiali in metode. Mišim smo injicirali samo VLB ali samo BLM ter obe zdravili v dveh kombinacijah: VLB injiciran 24 h pred BLM in BLM injiciran 24 h pred VLB. Učinkovitost terapije smo ugotavljali s preživetjem živali, štetjem celic, izoliranih iz peritonealne votline miši, ter DNA histogrami. Rezultati. Obe zdravili, bodisi kot mono kemoterapiji ali v kombinaciji, sta povzročili značilno zmanjšanje števila celic v peritonealni votlini v primerjavi s kontrolno skupino. Ko smo injicirali VLB 24 h pred BLM je bilo število celic v izolatu peritonealne votline značilno zmanjšano v primerjavi z monokemoterapijama in s skupino, ko smo BLM injicirali 24 h pred VLB. Preživetje živali, zdravljenih samo z VLB ali samo z BLM ter obema kombinacijama zdravil, je bilo značilno podaljšano glede na kontrolno nezdravljeno skupino miši. Obe kombinaciji VLB in BLM sta bili tudi bolj učinkoviti kot monokemoterapiji. Najboljši rezultat pa smo dobili pri skupini,kjer smo injicirali VLB 24 h pred BLM. V primerjavi z DNA histogramom kontrolnih celic smo v DNA histogramu celic, ki so bile izpostavljene delovanju VLB, izmerili zmanjšano število celic v S fazi in povečano število celic z večjo količino DNA, kot jo imajo celice v G2M fazi celičnega ciklusa. Doza BLM, ki smo jo uporabili v naših poskusih, ni imela učinka na progresijo celic skozi celični ciklus. Obe kombinaciji VLB in BLM sta imeli podoben celično kinetični učinek kot sam VLB. Zaključek. Glede na naše rezultate lahkozaključimo, da je mehanizem odgovoren za povečan učinek terapije, v kateri smo dali VLB 24 h pred BLM, predvsem povečana fluidnost celične membrane in verjetno tudi celično kinetični učinek V

[Učinki elektrokemoterapije na pretok krvi v tumorjih in njeni možni mehanizmi delovanja ciljani na žilje tumorja]

Background. The aim of this study was to determine the tumor blood flow modifying, and potential vascular targeted effect of electrochemotherapy with bleomycin or cisplatin. Materials and methods. Electrochemotherapy was performed by application of short intense electric pulses to the tumors after systemic administration of bleomycin or cisplatin. Evaluated were antitumor effectiveness of electrochemotherapy by tumor measurement, tumor blood flow modifying effect by Patent blue staining technique, and sensitivity of endothelial and tumor cells to the drugs and electrochemotherapy by clonogenicity assay. Results. Electrochemotherapy was effective in treatment of SA-1 tumors in A/J mice resulting in substantial tumor growth delay and also tumor cures. Tumor blood flow reduction following electrochemotherapy correlated well with its antitumor effectiveness. Virtually complete shut downof the tumor blood flow was observed already at 24 h after electrochemotherapy with bleomycin whereas only 50% reduction was observed after electrochemotherapy with cisplatin. Sensitivity of human endothelial HMEC-1 cells to electrochemotherapy suggests a vascular targeted effect for electrochemotherapy in vivo with bleomycin as well as with cisplatin. Conclusion. These results show that in addition to direct electroporation of tumor cells, other vascular targeted mechanisms are involved in electrochemotherapy with bleomycin or cisplatin, potentially mediated by tumorblood flow reduction, and enhanced tumor cell death as a result of endothelial damage by electrochemotherapy.Izhodišča. Namen naše raziskave je bil določiti vplive elektrokemoterapije s cisplatinom ali bleomicinom na pretok krvi v tumorjih in določiti njene možne mehanizme delovanja ciljane na žilje tumorja. Materiali in metode. Elektrokemoterapija je kombinirano zdravljenje sistemskega vbrizganja bleomicina in cisplatina nato pa sledi lokalna aplikacija električnih pulzov na tumor. V študiji smo ovrednotili protitumorski učinek elektrokemoterapije zmerjenjem velikosti tumorjev, učinek na pretok krvi v tumorjih z barvanjem tumorjev s Patentnim modrilom ter občutljivost endotelnih celic na citostatikain elektrokemoterapijo z merjenjem preživetja celic. Rezultati. Elektrokemoterapija je imela učinkovito protitumorsko delovanje, povzročila jevelik zaostanek v rasti tumorjev, nekateri tumorji so bili celo pozdravljeni. Zmanjšanje pretoka krvi v tumorjih je sovpadalo s protitumorsko učinkovitostjo elektrokemoterapije. Zaznali smo skoraj popoln zastoj pretoka krvi v tumorjih že po 24 urah po elektrokemoterapiji z bleomicinom, medtem ko je elektrokemoterapija s cisplatinom povzročila samo 50% zmanjšanje pretoka krvi v tumorjih. Občutljivost humanih endotelnih celic HMEC-1 na elektrokemoterapijo nakazuje ciljano delovanje te terapije na žilje tumorja invivo. Zaključki. Podatki kažejo, da je v protitumorskem delovanju elektrokemoterapije udeleženih več mehanizmov. Poleg povečanega dostavljanja kemoterapevtikov v tumorske celice z elektroporacijo, elektrokemoterapija tudizmanjša prekrvavitev tumorjev. Ta mehanizem je verjetno posredovan s smrtjo endotelnih celic, kar prav tako posredno povzroča smrt tumorskih celic

Soluble ST2 levels and left ventricular structure and function in patients with metabolic syndrome

Background: A biomarker that is of great interest in relation to adverse cardiovascular events is soluble ST2 (sST2), a member of the interleukin family. Considering that metabolic syndrome (MetS) is accompanied by a proinflammatory state, we aimed to assess the relationship between sST2 and left ventricular (LV) structure and function in patients with MetS. Methods: A multicentric, cross-sectional study was conducted on180 MetS subjects with normal LV ejection fraction as determined by echocardiography. LV hypertrophy (LVH) was defined as an LV mass index greater than the gender-specific upper limit of normal as determined by echocardiography. LV diastolic dysfunction (DD) was assessed by pulse-wave and tissue Doppler imaging. sST2 was measured by using a quantitative monoclonal ELISA assay. Results: LV mass index (β=0.337, P<0 .001, linear regression) was independently associated with sST2 concentrations. Increased sST2 was associated with an increased likelihood of LVH [Exp (B)=2.20, P=0.048, logistic regression] and increased systolic blood pressure [Exp (B)=1.02, P=0.05, logistic regression]. Comparing mean sST2 concentrations (adjusted for age, body mass index, gender) between different LV remodeling patterns, we found the greatest sST2 level in the group with concentric hypertrophy. There were no differences in sST2 concentration between groups with and without LV DD. Conclusions: Increased sST2 concentration in patients with MetS was associated with a greater likelihood of exhibiting LVH. Our results suggest that inflammation could be one of the principal triggering mechanisms for LV remodeling in MetS

Amnijska membrana kot biološki nosilec, njena priprava in uporaba v regenerativni medicini v Sloveniji

Izhodišča: Amnijska membrana (AM) je notranja stran posteljice, ki obdaja in ščiti zarodek. AM je večplastna struktura, ki je sestavljena iz amnijskih epitelijskih celic, amnijskih mezenhimskih stromalnih celic, bazalne lamine in vezivnega tkiva. Iz njene zgradbe izhajajo tudi lastnosti AM, zaradi katerih se že vrsto let uporablja v terapevtske namene, predvsem v oftalmologiji, saj pospešuje epitelizacijo, deluje kot substrat za celice, zmanjšuje fibrozo in neovaskularizacijo tkiva ter deluje protimikrobno. Zaradi mehanskih lastnosti AM, ki so posledica predvsem molekul zunajceličnega matriksa bazalne lamine in vezivnega tkiva, se AM v zadnjih letih vedno pogosteje uporablja tudi kot biološki nosilec v regenerativni medicini.   Zaključki: Regenerativna medicina je interdisciplinarno področje raziskav in kliničnih aplikacij, ki uporablja načela bioloških in inženirskih znanosti za razvoj živih tkivnih ali organskih nadomestkov. V regenerativni medicini ločimo tri pristope: 1) vsaditev funkcionalnih celic, med drugim tudi matičnih celic, v poškodovano ali okvarjeno tkivo, 2) uporaba različnih sintetičnih materialov ali materialov naravnega izvora, ki pomagajo pri ponovnem oblikovanju poškodovanega ali okvarjenega tkiva in 3) tkivno inženirstvo, tj. uporaba ustreznih nosilcev, ki spodbujajo rast tkivno specifičnih celic in oblikovanje novega tkiva. V prispevku predstavljamo tudi uporabo amnijske membrane kot biološkega nosilca v regenerativni medicini v Sloveniji

Vloga transmembranskega proteina jedrne ovojnice, Samp1, pri organizaciji kromatina, diferenciaciji in bolezni

The nucleus, a hallmark of eukaryotic cells, contains the genetic material called chromatin. Chromatin is organized and structured as transcriptionally inactive heterochromatin, most of which is found in the nuclear periphery, and transcriptionally active euchromatin, most of which is found in the nuclear interior. The nucleoplasm is separated from the cytoplasm by a nuclear envelope (NE) consisting of two concentric lipid membranes, nuclear pores, and the nuclear lamina. The nuclear lamina is formed by intermediate filament proteins, called lamins, and the nuclear envelope transmembrane proteins (NETs), which organize chromatin in the nuclear periphery. Out of several hundred NETs, only a small minority have been characterized, most of which show a high tissue diversity. Mutations of some of these nuclear envelope proteins cause a wide range of diseases called envelopathies or laminopathies. In this thesis, we focused on chromatin reorganization during differentiation and the roles of an inner nuclear membrane protein, Samp1, during differentiation, and Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD). We improved the previously developed method for quantitative monitoring of the epigenetic state of chromatin in live cells, called Fluorescent Ratiometric Imaging of Chromatin (FRIC). FRIC uses pTandemH vector that assures stoichiometrically constant expression of histones 3.3-EGFP and H2B-mCherry, markers for euchromatin and general chromatin, respectively. With the improved presentation of FRIC, it was possible for the first time to demonstrate an increase in heterochromatin in the nuclear periphery during the late-stage of neuronal differentiation and the role of Samp1 in promoting peripheral heterochromatin organization. The results also suggest that Samp1 can interact directly with the chromatin without the help of its binding partners at the nuclear envelope. We were also interested in Samp1 mutations that occur in patients with EDMD. In a recent study, three EDMD-connected mutations were found in the TMEM201 gene, encoding Samp1. While no effect of the mutants was traced in our experimental system, in HeLa and U2OS cells over-expression of YFP Samp1 caused a mislocalization of emerin, but in each of these lines, it had an opposite effect on the centrosome-to-nucleus distance, supporting the idea of the tissue-specific functions of Samp1.Celično jedro je največji organel evkariontskih celic, obdan z jedrno ovojnico (NE, Figure 1), dvojno koncentrično membrano, sestavljeno iz zunanje jedrne membrane (ONM), ki je povezana z zrnatim endoplazemskm retikulumom (ER), in notranje jedrne membrane (INM), v katero so vgrajeni številni proteini, ki pomagajo pri sidranju jedrne lamine (NL) in kromatina k obrobnemu delu jedra. Med ONM in INM je perinuklearni prostor (PNS), ki se nadaljuje v lumen ER. Prehajanje molekul med jedrom in citoplazmo poteka skozi jedrne pore, stičišča obeh membran, kjer se številni proteini, imenovani nukleoporini, povezujejo v makromolekularne komplekse jedrnih por, ki omogočajo dvosmerni aktivni transport molekul. Pod INM leži NL, omrežje intermediarnih filamentov (laminov), ki daje jedru mehansko podporo, omogoča prenos in ojačitev signalov med jedrom in citoskeletom in je vključeno v organizacijo kromatina, umeščanje in izražanje genov, celično signalizacijo, celični cikel, podvajanje DNA in številne druge celične procese. Za povezavo med nukleoskeletom in citoskeletom skrbi kompleks LINC, ki se s povezavami med proteini z domeno SUN in s proteini z domeno KASH (nesprini) razteza skozi obe membrani NE. Proteini z domeno SUN se v jedru vežejo na lamine, kromatin-vezavne proteine in druge proteine INM, v PNS pa se povežejo z nesprini, ki so v citoplazmi vezani na omrežja citoskeleta (mikrotubule, aktinske in intermediarne filamente). Kompleks LINC igra ključno vlogo v številnih celičnih procesih, organizaciji kromosomov in diferenciaciji. Genomska DNA je v evkariontskih celicah organizirana v kromatin, ki je sestavljen iz DNA in proteinov. Bolj zgoščen, transkripcijsko utišan kromatin, se imenuje heterokromatin in se nahaja v obrobnem delu jedra in okoli jedrca, transkripcijsko aktiven in manj zgoščen kromatin pa se imenuje evkromatin in se nahaja v osrednjem delu jedra. Organizacija kromatina je uravnavana preko različnih epigenetskih mehanizmov: metilacije DNA (kovalentni prenos metilne skupine na mesto 5C citozina, kar zniža prepisovanje genov), posttranslacijskih modifikacij histonov (med katerimi so najpogostejše acetilacija, metilacija in ubikvitinacija lizinov), različnih histonskih oblik, in delovanjem nekodirajočih RNA. Organizacija in regulacija kromatina je ključnega pomena za stabilnost in pravilno izražanje genov, za opravljanje celičnih funkcij, celično diferenciacijo in specializacijo. Pomembno vlogo pri organizaciji kromatina igra NE, ki s pomočjo laminov in transmembranskih proteinov jedrne lamine (NET-ov) privezuje kromatin k obrobnemu delu jedra. Razporeditev kromosomov v jedru ni naključna. V jedru sesalskih celic so kromosomi z manjšim številom genom pomaknjeni v jedrno periferijo, med tem ko so kromosomi, ki vsebujejo večji delež genov, locirani v osrednjem delu jedra. Celice različnega tkiva imajo različno prostorsko razporeditev kromosomov in organizacijo kromatina, saj sta le-ti odvisni od diferenciacije in specializacije celic. Med procesom celične diferenciacije pride do velikih sprememb v organizaciji kromatina. Medtem ko je kromatin matičnih celic zarodka (ESC) ohlapno zvit, brez značilnih območij heterokromatina, je v diferenciranih celicah v jedrni periferiji in okoli jedrca kromatin bolj strukturiran in kondenziran. V procesu diferenciacije se tako reorganizira več kot tretjina genoma. NE je dolgo časa veljala le za ločnico med jedrom in citoplazmo, dokler niso pred leti odkrili, da mutacije številnih NET-ov povzročajo bolezni jedrne ovojnice oz. jedrne lamine (envelopatije oz. laminopatije). Večina NET-ov je tkivno specifičnih, njihovo izražanje pa je odvisno od razvojne faze celic. Med najbolje raziskanimi NET-i so proteini z domeno SUN, proteini z domeno LEM (LAP2β, Emerin, MAN1), receptor lamina B (LBR) in Samp1, ki sodelujejo pri sidranju kromatina k NL. Samp1 (z vretenom povezan membranski protein 1) je prvi protein, ki so ga našli v delitvenem vretenu. Ima tri različne izooblike: Samp1a (43 kDa), Samp1b (62 kDa) in Samp1c (75 kDa), ki so produkti alternativnega spajanja. Samp1 ima velik nukleoplazmični N-konec s hidrofobno domeno, štiri ohranjene CXXC motive s potencialom za nastanek dveh cinkovih prtov in vezavo RNA/DNA in/ali proteinovSamp1a in Samp1b imata štiri transmembranske domene in nukleoplazmični C-konec, med tem ko ima Samp1c pet transmembranskih domen in C-konec v PNS (Figure 2). Izguba Samp1 destabilizira delitveno vreteno, kar povzroči napačno ločitev kromosomov. Samp1 je povezan tudi z kompleksom LINC in laminiizguba Samp1 povzroči destabilizacijo kompleksa LINC, kar onemogoči migracijo fibroblastov in odmik centrosoma proč od jedra. Izražanje proteina Samp1 je tkivno specifično, z visoko ravnjo izražanja v mišicah, možganih in testisih. Ključen je za diferenciacijo mišic, raven izražanja se med miogenezo za nekajkrat zviša, izguba proteina pa prepreči nastanek miocevk in s tem popolnoma prepreči miogenezo. Pomembno vlogo naj bi imel tudi pri sidranju heterokromatina na jedrno periferijo. Za kvantitativno spremljanje dinamične razporeditve kromatina v celicah smo uporabili metodo FRIC (fluorescentno ratiometrično slikanje kromatina). Metoda temelji na uporabi označevalcev za transkripcijsko aktiven kromatin H3.3-EGFP (Figure 4a) in splošen kromatin H2B-mCherry (Figure 4b), ki sta klonirana v vektor pTandemH (Figure 3), ki omogoča njuno stehiometrično konstantno izražanje. Program za analizo slik omogoča avtomatiziran izbor celic, katerih jedra ustrezajo željeni velikosti in se ne dotikajo roba slike. Nato izračuna površino jeder in intenziteto rdeče (H2B-mCherry) oz. zelene (H3.3-EGFP) fluorescence. Slike se normalizirajo z deljenjem posamezne fluorescence z njeno povprečno vrednostjo in varianco posameznih jeder. Normalizirana zelena fluorescenca (kanal H3.3) se nato deli z normalizirano rdečo fluorescenco (kanalom H2B), pri čemer nastane slika razmerij, ki prikazuje relativno epigenetsko stanje kromatina (Figure 4c). Jedro se nato razdeli v 20 ali 40 koncentričnih območij z enako širino. Povprečne vrednosti teh območij se nato načrtajo od jedrne periferije do središča jedra (1-20 oz. 1-40), s čimer nastane radialni profil, ki prikazuje kvantitativno porazdelitev kromatina v jedru celic. V prvem delu magistrske naloge je predstavljena izboljšana metoda FRIC z uporabo 75. percentila razmerja H3.3/H2B, ki predstavlja evkromatin (Figure 4d), in 75. percentila razmerja H2B/H3.3, ki predstavlja heterokromatin (Figure 4e), ki sta združena v eno sliko (Figure 4f). Heterokromatin je na sliki obarvan z rumeno, evkromatin pa s turkizno barvo, s čimer je porazdelitev kromatina v jedru celic predstavljena bolj jasno in razločno. Izboljšavo metode smo eksperimentalno ponazorili s pomočjo inhibitorjev histon deacetilaze (HDAC) in histon acetiltransferaze (HAT). Celice HeLa smo transficirali z vektorjem pTandemH in obdelali z inhibitorjem HDAC TSA oz. inhibitorjem HAT AA. Dodatek TSA (ki zviša raven acetilacije histonov) je povzročil upad perifernega heterokromatina, dodatek AA (ki zmanjša raven acetilacije histonov) pa je imel obraten efekt, nastalo je več heterokromatina v jedrni periferiji (Figure 5). S pomočjo izboljšane metode FRIC smo v nadaljevanju opazovali spremembe v organizaciji kromatina med nevrogenezo. Nevronski celični liniji SH SY5Y in PC6-3 smo transficirali z vektorjem pTandemH in diferencirali. Po petih dneh diferenciacije smo opazili porast perifernega heterokromatina v jedru obeh celičnih linij (Figure 6-7). Rezultati večine dosedanjih študij opisujejo spremembe v organizaciji kromatina v začetnih fazah razvoja, z našimi poskusi pa smo uspeli ponazoriti tudi spremembe v organizaciji kromatina v dokaj pozni fazi nevronske diferenciacije, ko ne prihaja več do tako znatnih sprememb v organizaciji kromatina kot v zgodnejših fazah razvoja. Iz literature je znano, da je Samp1 pomemben za diferenciacijo človeških induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC) in mišic, pripisujejo mu pomembno vlogo pri organizaciji kromatina. Zato smo preverili imunofluorescenčno raven proteina Samp1 med nevrogenezo in opazili značilen porast pri diferenciaciji celic PC6-3 (Figure 8). Za nadaljnje poskuse smo nato ustvarili poliklonsko celično linijo PC6-3 z izbitim genom za Samp1 (CrisprCas9 KO-Samp1, Figure 9). Kljub izbitju gena za Samp1, so se celice normalno diferencirale, s čimer smo pokazali, da Samp1 ni esencialen za nevrogenezo celic PC6-3. Zanimivo pa je bilo dognanje, da pri diferenciaciji celic z izbitim genom za Samp1 ne pride do značilnega porasta perifernega heterokromatina, kot ga je mogoče opaziti pri divjemu tipu celic, kljub normalni diferenciaciji celic. Prav tako smo opazili, da imajo nediferencirane celice z izbitim genom za Samp1 manj heterokromatina v jedrni periferiji v primerjavi z nediferenciranimi celicami divjega tipa, kar ponazarja, da Samp1 spodbuja nastanek perifernega heterokromatina v celičnem jedru. Da bi ugotovili kako protein Samp1 interagira s kromatinom (bodisi preko vezavnih partnerjev NE ali preko direktne vezave), smo pripravili jedrni fragment proteina Samp1, YFP-Samp1 (1-180), brez transmembranskih domen. Analiza izražanja jedrnega fragmenta v celicah U2OS je pokazala višjo kolokalizacijo YFP Samp1 (1-180) z Draq5 (markerjem kromatina) in H3K9me3 (markerjem heterokromatina), kot z YFP, kar nakazuje na direktno interakcijo proteina Samp1 s heterokromatinom, brez pomoči vezavnih partnerjev. Prva odkrita bolezen, ki jo povzročajo mutacije NET-ov, je bila Emery Dreifuss mišična distrofija (EDMD). Večina primerov bolezni je povezana z mutacijami emerina ali lamina A/C, za ostale primere pa je vzrok neznan. Simptomi EDMD so otrdelost sklepov, progresivna izguba mišične mase in mišična oslabelost, ter bolezni srca, kar na koncu privede do odpovedi srca. Nedavno so odkrili, da so mutacije gena, ki kodira protein Samp1, povezane z zgodnejšim pojavom simptomov in resnejšim potekom EDMD. Gre za substitucije glicina z alaninom ali serinom, kar bi lahko povzročilo stabilizacijo strukture Samp1. Da bi ugotovili mehanizem vpliva mutacij proteina Samp1 na resnejši potek EDMD, smo preverili lokalizacijo mutiranih proteinov Samp1 v celicah HeLa in U2OS. Med mutiranimi in nemutirano obliko proteina nismo opazili razlik (Figure 12), prav tako ni bilo mogoče zaznati značilnih sprememb v morfologiji ali velikosti jedra, kar bi nakazovalo na napake pri mitotski delitvi. Izguba proteina Samp1 običajno povzroči agregacijo emerina, ki je direktni vezavni partner Samp1 in eden izmed glavnih proteinov, katerih mutacije povzročajo nastanek EDMD. Medtem ko je prekomerno izražanje Samp1 povzročilo porast v številu celic z agregati emerina v celičnih linijah HeLa (21 % celic) in U2OS (75 % celic), mutirane oblike proteina Samp1 niso imele nobenega dodatnega vpliva na agregacijo (Figure 13). Iz prejšnje literature je znano, da izguba proteina Samp1 povzroči odmik centrosoma od jedra, kar je značilen fenotip celic bolnikov z EDMD. Naši rezultati v celicah HeLa so to potrdili. Do odmika centrosoma od jedra je v celicah HeLa prišlo tudi pri prekomernemu izražanju YFP-Samp1 (Figure 14), medtem ko se je centrosom v celicah U2OS s prekomernim izražanjem YFP-Samp1 pomaknil bližje k jedru. Prekomerno izražanje mutiranih oblik Samp1 ni imelo dodatnega učinka na položaj centrosoma v primerjavi z nemutirano obliko proteina v nobeni od uporabljenih celičnih linij. V magistrski nalogi smo z izboljšano metodo FRIC pridobili bolj jasno predstavo o organizaciji kromatina v jedru analiziranih celic. Pokazali smo, da je z izboljšano metodo FRIC mogoče zaznati občutljive spremembe v organizaciji kromatina tudi v poznejših fazah diferenciacije, ko spremembe v porazdelitvi hetero- in evkromatina niso več tako velike. V nalogi smo pokazali porast heterokromatina v jedrni periferiji med nevrogenezo in vlogo proteina Samp1 pri sidranju perifernega heterokromatina k NE. Rezultati prav tako nakazujejo na direktno interakcijo med proteinom Samp1 in kromatinom brez pomoči vezavnih partnerjev v NE. V zadnjem delu smo se osredotočili na mutacije proteina Samp1, ki so jih odkrili pri bolnikih z EDMD. Prekomerno izražanje YFP Samp1 je povzročilo agregacijo emerina v celicah HeLa in U2OS. Pri prekomernem izražanju YFP-Samp1 smo opazili tudi spremembe v položaju centrosoma, v celicah HeLa je prišlo do povečanja razdalje, medtem ko v celicah U2OS do zmanjšanja razdalje med centrosomom in jedrom, kar je v skladu s hipotezo o tkivno-specifičnih funkcijah proteina Samp1

Acute side effects of pelvic and abdominal irradiation

Obsevanje v področju trebuha in medenice je povezano s pojavom akutnih stranskih učinkov organov, ki se nahajajo v bližini obsevalnega tarčnega volumna. Prizadeto je predvsem tkivo z visoko proliferativno aktivnostjo celic - sluznice sečnega mehurja in gastrointestinalnega trakta, kostni mozeg in koža. Osnovni mehanizem nastanka je poškodba zarodnih celic, ki poruši ravnotežje med odmiranjem zrelih celic in nastajanjem novih. Temu se pridruži še vnetni odziv. Simptomi se običajno pojavijo 2 do 3 tedne po začetku obsevanja in trajajo še nekaj tednov po zaključku zdravljenja. Izrednega pomena je spodbujanje bolnikov k ustreznim preventivnim ukrepom. Zdravljenje je konzervativno in odvisno od stopnje izraženosti težav.Irradiation of the abdominal and pelvic cavities can result in acute side effects that are seen in the organs situated near the radiation target volume. The effect of radiotherapy is most potent against tissues with a high cell turnover – mucosa of the bladder and gastrointestinal tract, bone marrow, and skin. The acute symptoms are based on the radiation-induced damage to stem cells, resulting in an imbalance between ongoing cell loss and new cell production. This process is accompanied by inflammatory changes. Acute side effects usually present within 2-3 weeks after the onset of radiation and resolve in a couple of weeks after the completion of treatment. Encouraging patients to take appropriate preventive measures is of utmost importance. Treatment is conservative and depends on the severity of side effects

[Vloga p38 MAP kinaze pri apoptozi rakavih celic]

Background. Cellular behaviour in response to many extracellular stimuli is mediated through MAP kinase signalling pathways. p38 MAP kinase that is represented in mammals by four isoforms (p38alfa, p38beta, p38gama and p38delta) is one of the four main subgroups of MAP kinases. Recent studies show that p38 activation is necessary for cancer cell death initiated by variety of anti-cancer agents. This finding connected cancer therapies previously considered to be mechanistically unrelated and raised the possibility of developing anti-cancer agents that lack the side effects causedby events upstream of p38 MAPK Many of the details of p38 induced apoptosis still need to be elucidated. Since most of the past studies rely only on the cell culture models, all the results have to be verified using in vivo models. Also very little is known about the role of p38 mediated apoptosis on non-neoplastic cells in response to anti-cancer agents. Conclusion. Although p38 activation of cancer cell apoptosis is a very complexprocess, recent studies indicate a good starting point for new strategies that would increase the efficiency and decrease the toxicity of proven therapies.Izhodišča. Odzivanje celic na številne zunajcelične signale poteka preko aktivacije MAP kinaznih signalnih poti. Ena od štirih glavnih podskupin MAP kinaz je p38 MAP kinaza, ki je pri sesalcih prisotna v štirih izooblikah: p38alfa, p38beta, p38gama in p38delta. Nedavne raziskave so pokazale, da je zaaktivacijo apoptoze rakavih celic z različnimi kemoterapevtiki nujna aktivacija p38 kinaze. To spoznanje je v eni točki povezalo poti delovanja raznolikih kemoterapevtikov ter s tem nakazalo nove možnosti njihovega razvojabrez stranskih učinkov, ki jih sedaj povzročajo dogodki pred aktivacijop38. Veliko podrobnosti o p38 posredovani apoptozi je potrebno še razjasniti. Dosedanja dognanja je potrebno preveriti v in vivo modelih, saj seta sedaj nanašajo predvsem na celične kulture. Malo je znanega tudi o vlogi p38 pri apoptozi nerakavih celic po aktivaciji s kemoterapevtiki. Zaključki. Čeprav je p38 posredovana aktivacija apoptoze rakavih celic zelo kompleksen proces, novejše študije ponujajo dober začetek za razvoj novih kemoterapevtikov s povečano učinkovitostjo in zmanjšano toksičnostjo