Validación analítica de un kit de extracción in house para la amplificación de ácido ribonucleico de sars-cov-2

La emergencia sanitaria más grave de los últimos tiempos, producida por el virus SARS-CoV-2 generó un colapso en la salud y la economía de casi todos los países del mundo y ocasionó un déficit de recursos para su detección. La repentina aparición de la enfermedad trajo consigo un arduo proceso investigativo para la invención y mejora de técnicas moleculares indispensables para la detección de este virus. En este sentido, investigadores del Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico IIBT de la Universidad de Córdoba desarrollaron un kit in house para la extracción de ARN de SARS-CoV-2 y otros agentes biológicos de alto riesgo. En el siguiente trabajo, se tuvo como objetivo validar un kit de extracción in house para la amplificación de ácido ribonucleico de SARS-CoV-2, en el cual se determinó la estabilidad del kit, se realizó extracción de ARN a 50 muestras de hisopados nasofaríngeos de pacientes con síntomas de COVID-19 procesando la misma muestra con un kit comercial por perlas magnéticas y el kit de extracción in house. Se cuantificó y determinó la pureza del ARN extraído con los distintos protocolos mediante un espectrofotómetro, se realizó una RT-qPCR para detectar Gen E (gen de la proteína E de SARS-CoV-2) y RNasa P (Gen utilizado como control interno) y los resultados de Cq obtenidos para cada kit fueron comparados. Se determinó un porcentaje de positividad para estos datos. Los resultados de estabilidad indican que el pH del buffer de lisis del kit in house se mantiene entre 5.9 y 6 en temperaturas de 5°C a 26°C, conserva su coloración y no presenta formación de precipitado, todo esto durante 6 meses de estudio. La concentración y pureza del ARN de las muestras extraídas con el kit in house tuvieron mejores resultados, con una media de concentración de 119.2 ng/μL, y una media de Pureza de 2.2. Los Cq de Gen E y RNasa P obtenidos por ambos protocolos no mostraron diferencias significativas. Sin embargo, con el kit in house disminuyó la cantidad de resultados positivos. En conclusión, el kit in house resultó ser estable para ser utilizado en procesos de extracción de ARN. El kit de extracción in house elaborado y el protocolo de extracción son recomendables para obtener ARN de SARS-CoV-2 con optima pureza y concentración. Se infiere que el porcentaje de concordancia de los métodos pueden depender de factores como la calidad de la muestra inicial.1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 12. OBJETIVOS ............................................................................................................. 3Objetivo General ........................................................................................................ 3Objetivos Específicos ................................................................................................ 33. MARCO REFERENCIAL .......................................................................................... 4Antecedentes ............................................................................................................. 4Generalidades de SARS-CoV-2 ................................................................................. 5Métodos de extracción o aislamiento de ácido ribonucleico (ARN) ..................... 8Validación de pruebas diagnósticas ......................................................................... 134. METODOLOGÍA ..................................................................................................... 15Tipo de estudio ........................................................................................................ 15Obtención y almacenamiento de muestras ........................................................... 15Metodología desarrollada en el objetivo específico 1: ......................................... 15Metodología desarrollada en el objetivo específico 2: ......................................... 19Metodología desarrollada en el objetivo específico 3: ......................................... 265. RESULTADOS ....................................................................................................... 27Estabilidad de la formulación del buffer de lisis del kit de extracción in house 27Comparación de parámetros de pureza y concentración del ácido ribonucleico de SARS-CoV-2 extraído mediante el kit in house y un kit comercial de extracción por perlas magnéticas .......................................................................... 31Precisión diagnóstica del kit in house en la detección de material genético de SARS-CoV-2. ................................................................................................................ 336. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 367. RECOMENDACIONES .......................................................................................... 398. CONCLUSIONES ................................................................................................... 409. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 4110. ANEXOS ............................................................................................................. 44PregradoBiólogo(a)Pasantía