Mathematische Verfahren zur Aufklärung der Struktur, Dynamik und biologischen Aktivität von Molekülen unter Verwendung von NMR spektroskopischen und empirischen Parametern

In der vorliegenden Arbeit werden Verfahren der Mathematik und Informatik entwickelt und eingesetzt, um Struktur, Dynamik und biologische Aktivität aus NMR spektroskopischen und empirischen Parametern zu bestimmen. Dolastatin 10 und Epothilon A sind potentielle Wirkstoffe gegen Krebs, da sie durch Wechselwirkung mit Tubulin die Zellteilung unterbinden. Die 3D Struktur beider Wirkstoffe in Lösung und die Struktur von an Tubulin gebundenem Epothilon A wird aus NMR spektroskopischen Parametern bestimmt. Dolastatin 10 liegt in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der cis -- und trans -- Konformation in der ungewöhnlichen Aminosäure DAP vor. Beide Konformationen des flexiblen Pentapeptids können bestimmt werden mit RMSD = 1.423 Å für das cis -- Konformer und RMSD = 1.488 Å für das trans -- Konformer. Während das trans -- Konformer gestreckt vorliegt, faltet das cis -- Konformer am DAP zurück. Epothilone A ist durch einen Makrozyklus weniger flexibel und sowohl die an Tubulin gebundene Struktur (RMSD = 0.537 Å) als auch freie Form (RMSD = 0.497 Å) kann mit geringen RMSD -- Werten bestimmt werden. Die Struktur der freien Form, welche in Lösung hauptsächlich vorliegt, ist mit der Röntgenstruktur weitgehend identisch. In der an Tubulin gebundenen Form wird eine essentielle Umorientierung der Seitenkette beobachtet, die für die Wechselwirkung mit Tubulin entscheidend ist. Dipolare Kopplungen eines Proteins sind geeignet, eine 3D Homologiesuche in der PDB durchzuführen, da die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen und Domänen durch sie beschrieben wird 85 . Die frühe Erkennung 3D homologer Proteinfaltungen eröffnet die Möglichkeit, die Bestimmung von Proteinstrukturen zu beschleunigen. Eine Homolgiesuche unter Nutzung dipolarer Kopplungen ist in der Lage, Proteine oder zumindest Fragmente mit ähnlicher 3D Struktur zu finden, auch wenn die Primärsequenzhomologie gering ist. Darüber hinaus wird eine Transformation für experimentelle dipolare Kopplungen entwickelt, die die indirekte Orientierungsinformation eines Vektors relativ zu einem externen Tensor in den möglichen Bereich für den Projektionswinkel zwischen zwei Vektoren und somit in eine intramolekulare Strukturinformation übersetzt. Diese Einschränkungen können in der Strukturbestimmung von Proteinen mittels Molekulardynamik genutzt werden 92 . Im Gegensatz zu allen existierenden Implementierungen wird die Konvergenz der Rechnung durch die auf diese Weise eingeführten dipolare Kopplungsinformation kaum beeinflusst. Die dipolaren Kopplungen werden trotzdem von den errechneten Strukturen erfüllt. Auch ohne die Nutzung bereits bekannter Protein­ oder Fragmentstrukturen kann so ein erheblicher Teil der NOE -- Information substituiert werden. Die Dynamik des Vektors, der die beiden wechselwirkenden Dipole verbindet, beeinflusst den Messwert der dipolaren Kopplung. Dadurch wird Information über die Dynamik von Molekülen auf der µs­Zeitskala zugänglich, die bisher nur schwer untersucht werden konnte. Die Messung dipolarer Kopplungen für einen Vektor in verschiedenen Orientierungen erlaubt die Analyse seiner Bewegung 89 . Im besonderen ist die Ableitung eines modellfreien Ordnungsparameters 2 S möglich. Weiterhin lassen sich ebenso modellfrei eine mittlere Orientierung des Vektors, axialsymmetrische Anteile und nichtaxialsymmetrische Anteile der Dynamik ableiten und auswerten. Die Anwendung der so entwickelten Protokolle auf experimentelle Daten 90 lässt Proteine deutlich dynamischer erscheinen als auf der Zeitskala der Relaxationsexperimente zu erkennen ist. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 auf 0.6. Dies entspricht einer Erhöhung des Öffnungswinkels der Bewegung von ca. 22 ° auf ca. 33°. Die Bewegungen weichen teilweise bis zu 40% und im Mittel 15% von der Axialsymmetrie ab. Neuronale Netze erlauben eine schnelle (ca. 5000 chemische Verschiebungen pro Sekunde) und exakte (mittleren Abweichung von 1.6 ppm) Berechnung der 13 C NMR chemischen Verschiebung 115 . Dabei kombinieren sie die Vorteile bisher bekannter Datenbankabschätzungen (hohe Genauigkeit) und Inkrementverfahren (hohe Geschwindigkeit). Das 13 C NMR Spektrum einer organischen Verbindung stellt eine detaillierte Beschreibung seiner Struktur dar. Resultate des Strukturgenerators COCON können durch den Vergleich des experimentellen mit den berechneten 13 C NMR Spektren auf ca. 1 o/oo der vorgeschlagenen Strukturen eingeschränkt werden, die eine geringe Abweichung zum experimentellen Spektrum haben 122 . Die Kombination mit einer Substrukturanalyse erlaubt weiterhin die Erkennung wahrscheinlicher, geschlossener Ringsysteme und gibt einen Überblick über die Struktur des generierten Konstitutionssubraumes. Genetische Algorithmen können die Struktur organischer Moleküle ausgehend von derer Summenformel auf eine Übereinstimmung mit dem experimentellen 13 C NMR Spektrum optimieren. Die Konstitution von Molekülen wird dafür durch einen Vektor der Bindungszustände zwischen allen Atom -- Atom Paaren beschrieben. Selbige Vektoren sind geeignet, in einem genetischen Algorithmus als genetischer Code von Konstitutionen betrachtet zu werden. Diese Methode erlaubt die automatisierte Bestimmung der Konstitution von Molekülen mit 10 bis 20 Nichtwasserstoffatomen 123 . Symmetrische neuronale Netze können fünf bzw. sieben dimensionale, heterogene Parameterrepräsentationen der 20 proteinogenen Aminosäuren unter Erhalt der wesentlichen Information in den dreidimensionalen Raum projizieren 134 . Die niederdimensionalen Projektionen ermöglichen eine Visualisierung der Beziehungen der Aminosäuren untereinander. Die reduzierten Parameterrepräsentationen sind geeignet, als Eingabe für ein neuronales Netz zu dienen, welches die Sekundärstruktur eines Proteins mit einer Genauigkeit von 66 % im Q 3 -- Wert berechnet. Neuronale Netzte sind aufgrund ihrer flexiblen Struktur besonders geeignet, quantitative Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität zu beschreiben, da hier hochgradig nichtlineare, komplexe Zusammenhänge vorliegen. Eine numerische Codierung der über 200 in der Literatur beschriebenen Epothilonderivate erlaubt es, Modelle zur Berechnung der Induktion der Tubulin Polymerisation (R = 0.73) und der Inhibierung des Krebszellenwachstums (R = 0.94) zu erstellen 136 . Die trainierten neuronalen Netze können in einer Sensitivitätsanalyse genutzt werden, um die Bindungsstellen des Moleküls zu identifizieren. Aus der Berechnung der Aktivität für alle Moleküle des durch die Parameter definierten Strukturraums ergeben sich Vorschläge für Epothilonderivate, die bis zu 1 000 mal aktiver als die bisher synthetisierten sein könnten

Automatische sequentielle Zuordnung von mehrdimensionalen Protein-NMR-Spektren sowie molekulardynamisch gestützte stereospezifische Zuordnung von Seitenkettenamidgruppen in Modellpeptiden

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die stereospezifischen Zuordnungen der Seitenkettenamidgruppen der Random-Coil-Modellpeptide Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 und Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 ermittelt. Stereospezifische Zuordnungen werden meistens mit Hilfe von Datenbanken bereits gelöster Biomoleküle bestimmt. Die bekannteste dieser Datenbanken ist die Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB). Untersucht man die in der BMRB gespeicherten chemischen Verschiebungen genauer, so findet man Inkonsistenzen bei den stereospezifischen Zuordnungen. Es wurde außerdem festgestellt, dass die beiden Programme SHIFTS und SHIFTX, die chemischen Verschiebungen aus den 3D-Strukturen von Peptiden und Proteinen vorhersagen können, Resonanzen ebenfalls stereospezifisch falsch zuordnen können. Für die stereospezifische Zuordnung wurden NOESY-Spektren der Random-Coil-Peptide von Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 und Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 aufgenommen. Mit AUREMOL RELAX, das den vollständigen Relaxationsmatrixformalismus verwendet, wurden entsprechende Spektren aus Molekulardynamik (MD) Rechnungen der beiden Tetrapeptide simuliert. Ein Vergleich der experimentellen und simulierten Signalvolumina erbrachte eine eindeutige stereospezifische Zuordnung der Random-Coil-Verschiebungen der Seitenkettenamid- und Hβ-Protonen der beiden Aminosäuren. Die vorgestellte Methode hat das Potential in zukünftigen Arbeiten auf einen großen Teil aller Aminosäuren übertragen zu werden, um eine vollständige stereospezifische Random-Coil-Verschiebungsdatenbank zu erzeugen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde SIBASA, das neue AUREMOL Modul zur automatischen Zuordnung von HSQC-Spektren und NMR-Protonenresonanzen vorgestellt. SIBASA basiert auf dem Top-Down-Ansatz und bestimmt die vollständige Zuordnung eines Proteins, indem es die optimale Übereinstimmung zwischen experimentellen und mit variablen chemischen Verschiebungen zurückgerechnete NOESY-Spektren findet. Durch den Top-Down-Ansatz ist es möglich 2-D-NOESY-Spektren von großen Proteinen als Informationsquelle der automatische Zuordnung zu verwenden. SIBASA benötigt für die vollständige Zuordnung der Protonen und Stickstoffresonanzen eine 3D-Struktur des Proteins, das 2-D-NOESY- und das 3D 15N-NOESY-HSQC-Spektrum. Die Rückrechnungen der NOESY-Spektren werden wieder mit AUREMOL RELAX erzeugt. RELAX wertet zudem MD-Trajektorien aus, um Informationen über lokale Beweglichkeit im Protein erhalten. Mithilfe der Programme SHIFTS und SHIFTX2 kann SIBASA Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen der chemischen Verschiebungen der zuzuordnen Kerne aus der MD-Trajektorie des betrachten Proteins vorhersagen, was zur Verbesserung der Zuverlässigkeit und Geschwindigkeit der automatischen Zuordnung führt. Die optimale Übereinstimmung der experimentellen und der zurückgerechneten NOESY-Spektren wird durch den Threshold-Accepting-Algorithmus, der in mehreren Instanzen mit verschiedenen Startzuordnung ausgeführt wird, bestimmt. Mehrere Instanzen helfen SIBASA die wahrscheinlichste vollständige Zuordnung zu finden und sind Voraussetzung für die Verifikation. SIBASA ist in der Lage, jeder automatisch gefundene Zuordnung eine Wahrscheinlichkeit zuzuordnen. Die automatische Zuordnung wurde mit den NOESY-Spektren und den Röntgenstrukturen der Proteine von S. aureus HPr (H15A) (88 Aminosäuren), von Thioredoxin Plasmodium falciparum (PfTrx) (104 Aminosäuren) und von Ras(T35S)-GppNHp (166 Aminosäuren) getestet. SIBASA konnte 91,3 % der Resonanzen von HPr (H15A), 81,9 % der Resonanzen von PfTrx und 77,6 % der Resonanzen von Ras(T35S)-GppNHp richtig zuordnen. Eine Verifikation auf dem signifikanten Niveau ermöglicht es, einen großen Teil der falschen Zuordnungen von den richtigen zu trennen. Insgesamt erhielten 77,8 % der automatisch gefunden Resonanzzuordnungen von HPr (H15A), 77,5 % der gefunden Resonanzzuordnungen von PfTrx und 66,8 % der Resonanzzuordnungen von Ras(T35S)-GppNHp von SIBASA eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 95 %. Von diesen Resonanzen sind beim HPr (H15A) nur 3,5 %, beim PfTrx nur 9,7 % und beim Ras(T35S)-GppNHp nur 10,2 % falsch zugeordnet worden. Es wurde anhand der drei Proteine gezeigt, dass SIBASA in der Lage ist HSQC-Spektren sicher teilzuordnen. Das HSQC-Spektrum von HPr (H15A) konnte von SIBASA vollständig richtig zugeordnet werden. Beim PfTrx waren 90 % und beim Ras(T35S)-GppNHp 88 % der automatisch gefundenen HSQC-Zuordnungen richtig. Vertraut man nur Zuordnungen von HSQC-Signalen, die von SIBASA bestätigt wurden, so konnten 82 % der Signale von HPr (H15A), 72 % der Signale von PfTrx und 68 % der HSQC-Signale des Ras(T35S)-GppNHp richtig zugeordnet werden. In keinem Fall enthielt die Gruppe der bestätigten Signale eine falsche Zuordnung. Das vorgestellte Modul ermöglicht es für die Wirkstoffentwicklung wichtige [1H,15N]-HSQC-Spektren automatisch zuzuordnen, ohne auf die umständliche Markierung der Proteine mit dem Isotop 13C zurückgreifen zu müssen, wobei eine Kristall- oder eine NMR-Struktur eines homologen Proteins verfügbar ist