Sulfur and baking-quality of breadmaking wheat

It is well known in biological science that all factors applied to living organisms (light, water, warmth, fertilizers etc.) show an optimum, when their input is increased. Healthy organisms and sus-tainable systems are, on the long run, only achieved when care is taken not to destroy this equilibrium of factors producing an optimum. With regard to the baking quality of wheat breeders and cereal scientists obviously failed to achieve this aim by breeding their cultivars on the background of ample S depositions in the ecosystems. They (involuntarily) selected plants showing definite characteristics of S deficiency (higher proportions of HMW-glutenin, stronger gluten and dough) even under conditions of ample S supply. I suppose they also selected plants with a high warmth susceptibility as this also delivers firm protein structure. When this environ-mental pollution was stopped and S supplies returned to natural conditions, even with a non S craving plant like wheat, problems arose with the gluten structure as doughs turned out so strong that the baking volume decreased. So one may ask, particularly with regard to S, if the plant constitutions of our modern wheat cultivars are still harmonious and in balance. And as a consequence ot that also the nutritional quality of these cultivars is rather questionable

Untersuchungen zur Rolle der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und des NADP+-Malat-Enzyms in der filamentösen Phaeophycee Ectocarpus siliculosus

In der filamentösen Braunalge Ectocarpus siliculosus liegen die Enzyme Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) und das NADP+-Malat-Enzym in hohen Aktivitäten vor. Die Beteiligung beider Enzyme an einem für die Alge vorgeschlagenen C4/CAM-Metabolismus wurde fraglich, nachdem zum einen nicht alle der für einen vollständigen Zyklus benötigten Enzyme nachgewiesen werden konnten und zum anderen mögliche Metabolite in vivo in zu geringen Konzentrationen vorlagen, um für den postulierten Speichermetaboliten von CO2 in Frage zu kommen. Daraus ergab sich die Frage nach der zellulären Funktion der Enzyme. Zur Klärung der Funktion sowohl der PEPCK als auch des NADP+-Malat-Enzyms wurden die Enzyme aus E. siliculosus isoliert und gereinigt. Dabei wurde für die native PEPCK eine relative molekulare Masse von 90 kDa ermittelt. Nach Denaturierung in der SDS-PAGE zeigte sich ein 62 kDa- sowie ein prominenteres 18 kDa-Polypeptid. Die relative molekulare Masse des nativen NADP+-Malat-Enzyms wurde mit 440 kDa bestimmt. In der SDS-PAGE zeigte sich ein einzelnes 56 kDa-Polypeptid, und es wurde geschlossen, dass das funktionelle Enzym als Oktamer vorliegt. Für alle der für die Carboxylierungsreaktion der PEPCK benötigten Substrate ergaben sich normale Michaelis-Menten-Kinetiken mit den Km-Werten 1,46 mM (CO2), 0,5 mM (PEP) und 0,23 mM (ADP). Auch für die Decarboxylierungsreaktion des Malat-Enzyms zeigte sich mit Malat eine normale Michaelis-Menten-Kinetik (Km = 0,36 mM). Im Fall des NADP+ wurde das Vorliegen positiver Kooperativität mit einem Hill-Koeffizienten von 2,74 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, daß das Enzym über mindestens drei Bindungsstellen für NADP+ verfügt. Zur Herstellung spezifischer Antikörper gegen beide Enzyme wurden Kaninchen mit den denaturierten Polypeptiden nach der SDS-PAGE immunisiert. Trotz wiederholtem Ansatz und verlängertem Standardimmunisierungsprogramm ergab sich ein geeignetes Antiserum nur für das 18 kDa-Polypeptid der PEPCK. Die IgG-Fraktion dieses Serums reagierte sowohl mit dem 18 kDa- als auch mit dem 62 kDa-Polypeptid der PEPCK, was darauf hindeutet, dass beide Polypeptide Degradationsprodukte eines wahrscheinlich monomeren nativen Polypeptids sind. In Immunlokalisationsstudien mit diesem Antikörper wurde die PEPCK in den Pyrenoiden von E. siliculosus nachgewiesen. Ebenso befindet sich die Rubisco, nachgewiesen mit einem Antikörper gegen das native Enzym aus Spinat, in den Pyrenoiden. Die Lokalisation der PEPCK in direkter Nachbarschaft zur Rubisco schließt erneut die Funktion eines C4-Mechanismus bei E. siliculosus aus. Eine anaplerotische Rolle der PEPCK in den Zellen der Alge ist wahrscheinlich

Retrospektive cytogenetische und molekularcytogenetische Abklärungvon ätiologisch ungeklärten Aborten mit morphologisch auffälligen Feten

Der hohe Anteil chromosomaler Imbalancen in der Frühschwangerschaft impliziert die Notwendigkeit einer intensiven cytogenetischen Untersuchung sowohl der Aborte als auch der Paare mit Aborten. Chromosomenanalysen aus Abortgewebe sind jedoch häufig durch die geringe mitotische Aktivität der Zellen und die geringe Bandenqualität der Chromosomen limitiert. Die Comparative Genomhybridisierung (CGH) ist eine molekularcytogenetische Methode, welche chromosomale Imbalancen durch reverse Fluoreszenz- in situ-Hybridisierung zuverlässig aufdecken kann. Um das diagnostische Potential der CGH zu evaluieren, wurden in der vorliegenden Studie 51 Aborte retrospektiv untersucht. Insbesondere sollte die Sensitivität der CGH anhand von 29 cytogenetisch bereits vordiagnostizierten Fällen ermittelt werden. In insgesamt 12 Fällen wurden neben der CGH noch weitere Techniken wie die chromosomale Mikrodissektion, Fluoreszenz- in situ-Hybridisierung (FISH) und die Mikrosatellitenanalyse zur präzisen Abklärung der genomischen Imbalancen angewandt. Mittels dieser Techniken konnte der Ursprung eines Markerchromosoms sowie einer neu entstandenen unbalancierten Translokation identifiziert werden. Die Mikrosatellitenanalyse ermöglichte die Bestimmung der parentalen Herkunft und Entstehungszeitpunkt von Trisomien sowie den Ausschluss einer uniparentalen Disomie in insgesamt 10 Fällen. Grundvoraussetzung für eine CGH-Analyse ist die Gewinnung einer möglichst hochmolekularen DNA. Dazu wurde DNA aus nativem und Formalin fixierten und paraffinierten Geweben in insgesamt 42 Abortfällen gewonnen. Anhand der Ergebnisse der CGH-Analysen wurden folgende Parameter beurteilt: Alter der Gewebeblöckchen, Dauer der Formalinfixierung und Mazeration/Autolyse des Ausgangsgewebes. Das Alter der asservierten Gewebeblöckchen reichte von wenigen Wochen bis zu 18 Jahre. Anhand der Untersuchungsergebnisse konnte festgestellt werden, dass die Lagerungsdauer in Paraffin keinen oder einen nur geringen Einfluss auf die Qualität der DNA hatte. Je kürzer jedoch die Fixationsdauer des Gewebes in Formalin war, umso eher ließ sich eine qualitativ und quantitativ hochwertige DNA gewinnen. Keine direkte Korrelation konnte dagegen zwischen DNA-Qualität und dem Mazerationsgrad/Autolysegrad des eingebetteten Gewebes festgestellt werden. Anhand der Ergebnisse der CGH-Analyse wurde die DNA in 3 Kategorien unterteilt: 1. DNA-Fragmente mit einer Länge von 200-1500bp und mehr (optimale Fragmentlänge) ermöglichten ein CGH-Ergebnis in 100% der Fälle. 2. Leicht degradierte DNA (Fragmentlänge 200-700bp) führte zu einem CGH-Ergebnis in 67% der Fälle. 3. Stark degradierte DNA mit Fragmentlängen <500bp eignete sich nicht für eine CGH-Analyse. In der vorliegenden Studie wurde die Comparative Genomhybridisierung zur retrospektiven Analyse von 51 Aborten angewandt. In 42/51 Fällen (82,4%) konnte mittels CGH in Verbindung mit Mikrosatellitentypisierung und Fluoreszenz- in situ-Hybridisierung ein Ergebnis erzielt werden. In 22/42 Fällen (52,4%) lag ein unauffälliges Ergebnis vor. In 5 Fällen konnte ein normaler Chromosomensatz mittels CGH bestätigt werden. In 2 Fällen wurde über eine anschließende Mikrosatellitenanalyse eine Triploidie gesichert. In 9/22 Fällen lag ein cytogenetischer Vorbefund mit einer Strukturaberration vor. Hierbei handelte es sich um Markerchromosomen (3 Fälle), Ringchromosomen (3 Fälle) und unbalancierte Translokationen (3 Fälle). Bezogen auf strukturelle Veränderungen war die Rate der falsch negativen Ergebnisse nach CGH in 9/14 Fällen mit 64,3% hoch. Hierfür ursächlich war neben degradierter DNA das limitierte Auflösungsvermögen der CGH. In 20 Fällen (47,6%) wurden sowohl numerische als auch strukturelle Aberrationen nachgewiesen. Darüber hinaus gab in einem Fall die CGH-Analyse neben dem Nachweis der chromosomalen Aberration auch Hinweis auf den Entstehungsmechanismus der Chromosomenaberration. Trotz der Einschränkung beim Nachweis struktureller Veränderungen, die jedoch im Abortgeschehen eher eine untergeordnete Rolle spielen, belegen die erhobenen Daten, dass die retrospektive CGH-Analyse an archiviertem Abortmaterial, eine potente Methode zur Aufdeckung genetischer Imbalancen bei Aborten ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die CGH in der Fetalpathologie sowohl zur Aufdeckung von de novo-Aberrationen in Nachkommen von genetisch unauffälligen Eltern, als auch zur Bestätigung von unbalancierten Situationen in Nachkommen von einem Elternteil mit reziproker Chromosomenaberration sinnvoll angewendet werden kann. Erst die Aufdeckung und Abklärung chromosomaler Aberrationen als Ursache für Aborte und fetale Fehlbildungen ermöglicht eine detaillierte Phänotyp-Genotyp-Korrelation, eine präzise Abschätzung des Wiederholungsrisikos für die Eltern im Rahmen einer genetischen der Beratungssituation

Is Neolithic land use correlated with demography? An evaluation of pollen-derived land cover and radiocarbon-inferred demographic change from Central Europe

The transformation of natural landscapes in Middle Europe began in the Neolithic as a result of the introduction of food-producing economies. This paper examines the relation between land-cover and demographic change in a regionally restricted case study. The study area is the Western Lake Constance area which has very detailed palynological as well as archaeological records. We compare land-cover change derived from nine pollen records using a pseudo-biomisation approach with 14C date probability density functions from archaeological sites which serve as a demographic proxy. We chose the Lake Constance area as a regional example where the pollen signal integrates a larger spatial pattern. The land-cover reconstructions for this region show first notable impacts at the Middle to Young Neolithic transition. The beginning of the Bronze Age is characterised by increases of arable land and pasture/meadow, whereas the deciduous woodland decreases dramatically. Changes in the land-cover classes show a correlation with the 14C density curve: the correlation is best with secondary woodland in the Young Neolithic which reflects the lake shore settlement dynamics. In the Early Bronze Age, the radiocarbon density correlates with open land-cover classes, such as pasture, meadow and arable land, reflecting a change in the land-use strategy. The close overall correspondence between the two archives implies that population dynamics and land-cover change were intrinsically linked. We therefore see human impact as a key driver for vegetation change in the Neolithic. Climate might have an influence on vegetation development, but the changes caused by human land use are clearly detectable from Neolithic times, at least in these densely settled, mid-altitude landscapes

Untersuchungen zur Rolle von Cytochrom P450-Enzymen in der Biosynthese von Aryltetralin-Lignanen in Zellkulturen von Linum spec.

Lignane sind phenolische Verbindungen des pflanzliche Sekundärstoffwechsels, die sich von der Aminosäure Phenylalanin ableiten, über das Pflanzenreich weit verbreitet sind und die vielfältige pharmazeutisch-medizinische Bedeutungen haben können. Podophyllotoxin (PTOX), ein Aryltetralin-Lignan, ist stark cytotoxisch und dient u.a. als Ausgangs-substanz der halbsynthetischen Glycoside Etoposid und Teniposid, die als Chemotherapeutika eingesetzt werden. Wildsammlungen von Podophyllum spec. stellen momentan die hauptsächliche Bezugsquelle für Podophyllotoxin dar. Außerdem konnten Aryltetralin-Lignane auch in einigen Leinarten (Linum spec.) nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen zur Biosynthese von Lignanen wie PTOX oder 6-Methoxypodophyllotoxin (MPTOX) in Suspensionskulturen von Linum album, L. flavum und L. nodiflorum beschrieben. Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Rolle beschriebener oder vermuteter Cytochrom P450-abhängiger Oxygenasen, einer Enzymklasse, die viele oxidative Reaktionen im pflanzlichen Sekundärstoffwechsel katalysiert. Biotransformationsversuche in L. nodiflorum deuten darauf hin, dass der Umsatz von Desoxypodophyllotoxin (DOP) zu PTOX durch eine DOP7H Cytochrom P450-abhängig sein könnte, da er durch den spezifischen Inhibitor Tetcyclacis gehemmt wird. In Mikrosomen-präparationen aus Linum nodiflorum war keine DOP7H-Aktivität nachweisbar. Die kürzlich in L. flavum beschriebene Desoxypodophyllotoxin 6-Hydroxylase (DOP6H), die den Umsatz von DOP zu &#61538;-Peltatin katalysiert, konnte in Zellkulturen von L. nodiflorum nachgewiesen und in zellfreien Extrakten charakterisiert werden. Ihre höchste Aktivität weist die DOP6H aus L. nodiflorum bei pH 7,4 und etwa 35 °C auf. Die hemmende Wirkung verschiedener Cytochrom P450-spezifischer Inhibitoren, wie Cytochrom c oder Tetcyclacis wurde gezeigt. Außerdem konnten hemmende Effekte des Substratanalogons 4&#8217;-Demethyl-DOP, sowie divalenter Kationen, insbesondere Mn2+ festgestellt werden. Als Km-Werte für das Substrat Desoxypodophyllotoxin (DOP) und das Cosubstrat NADPH wurden 8,3 µM und 47 µM ermittelt. Die Bedeutung des alternativen Cosubstrats NADH wurde untersucht, wobei kein synergistischer (überadditiver) Effekt festgestellt werden konnte, wie er von vielen tierischen und humanen Cytochrom P450-Systemen bekannt ist. Die geringe Enzymaktivität mit NADH verweist auf eine mögliche Beteiligung von Cytochrom b5 an der Elektronen-transport-kette zur DOP6H in vitro. Außerdem werden Ansätze zur biotechnologischen Verwendbarkeit der DOP6H, wie die Verwendung von Zn/Co(III)-Sepulchrat als alternative Elektronendonatoren anstelle von NADPH und eine Aufreinigungsstrategie über eine Affinitäts-chromato-graphie mit Hilfe des Substratanalogons 4&#8217;-Demethyl-DOP diskutiert. Yatein gilt als mögliche direkte Vorstufe von DOP in der Lignan-Biosynthese. Ein Umsatz von Yatein zu DOP, wie in Podophyllum spec. beschrieben, konnte in den untersuchten Zellkulturen nicht nachgewiesen werden. Dies kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass die Biosynthesewege in den Gattungen Linum und Podophyllum unterschiedlich verlaufen könnten. Die mögliche Bedeutung von Yatein wird diskutiert. Zusätzlich wurde damit begonnen NADPH:Cytochrom P450-Reduktasen (CPR) aus den genannten Zellkulturen zu klonieren. Für den Ablauf Cytochrom P450-abhängiger Reaktionen sind diese Reduktasen als Elektronendonatoren notwendig. Durch RT-PCR konnten mit Hilfe genspezifischer Primer Teilklone für CPRs aus L. album, L. flavum und L. nodiflorum isoliert werden. DOP scheint ein Verzweigungspunkt in der Lignan-Biosynthese zu sein, da es eine Vorstufe sowohl von PTOX als auch MPTOX ist. Das genauere Verständnis der enzymatischen Umsetzung von DOP ermöglicht eine Abschätzung des bio-techno-logischen Potentials der Lignan-Biosynthese in Zellkulturen von Linum spec

Kinetische Untersuchungen und Modellstudien zur Funktion essentieller Reste im aktiven Zentrum der L-Asparaginase II aus E. coli

Peroxisomes are compartments in cells called organelles that perform many different functions. In humans, peroxisomal defects result in serious disorders, leading to early death. Peroxisomes need proteins to perform their function but they cannot make these proteins themselves. Therefore, peroxisomes take up (import) proteins from the cytosol, which is the fluid that surrounds organelles inside cells. Under certain conditions, peroxisome numbers need to be increased in cells, and one way to achieve this is by the division of pre-existing ones. This process is termed ‘fission’ but we do not understand fully how this occurs. In this thesis, we have studied details of the peroxisomal fission and import processes by analysing them in yeast. Pex11p is a protein which is important for peroxisome fission. Pex11p reshapes the peroxisomal membrane so that peroxisomes can start dividing. We investigated how Pex11p is stimulated to perform this function and how it interacts with the peroxisomal membrane. Our studies indicate that membrane reshaping occurs due to Pex11p interacting with specific regions of the membrane. Proteins destined for peroxisomes contain Peroxisome Targeting Signals (PTS) that are recognized by proteins Pex5p and Pex7p. These receptors transport PTS containing proteins from the cytosol, where they are made, into peroxisomes. We have identified that Aspartate aminotransferase-2 (Aat2p) localises to peroxisomes despite lacking a classical PTS. Peroxisomal localisation persisted in the absence of Pex5p and Pex7p. Instead, Pex20p is required for targeting. Functional analysis suggests that Aat2p may contribute to the regulation of metabolism inside peroxisomes

Die Biosynthese cytotoxischer Lignane aus Linum nodiflorum L. (Linaceae): ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase

Lignane sind im Pflanzenreich weit verbreitete phenolische Sekundärstoffe, von denen Vertreter mit cytotoxischer, antimykotischer und antimikrobieller Wirkung bekannt sind. Das Aryltetralinlignan Podophyllotoxin, das aus Podophyllum peltatum oder Podophyllum hexandrum gewonnen wird, dient als Ausgangsstoff der semisynthetischen Krebs-medikamente Etoposid, Teniposid und Etopophos&#61650;. Aber auch in Linaceae ist das Vorkommen von Aryltetralinlignanen, darunter auch Podophyllotoxin, bekannt. An Suspensionskulturen von Linum nodiflorum (Linaceae), in denen 6-Methoxypodophyllotoxin anstatt Podophyllotoxin als Endprodukt der Lignanbiosynthese vorkommt, soll der Syntheseweg der Aryltetralinlignane aufgeklärt werden. Ausgehend von ß-Peltatin soll die Methylierung zu ß-Peltatin-A Methylether gezeigt werden. In dieser Arbeit kann die ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase (POMT) in Suspensionskulturen von Linum nodiflorum (Linaceae) erstmals nachgewiesen und beschrieben werden. Neben einem Enzymtest wird eine HPLC-Methode zur Auswertung etabliert. Die ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase überträgt eine Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin (SAM) auf ß Peltatin, wodurch der ß-Peltatin-A Methylether gebildet wird. Die Identität des Produkts wird über 1H- und 13C-NMR bestätigt. Das Enzym hat ein Temperaturoptimum von 40 °C und arbeitet optimal bei einem pH-Wert von 7,5 in 0,1 M Tris-HCl-Puffer. Für ß-Peltatin wurde ein apparenter Km-Wert von 40 µM und für SAM von 15 µM bestimmt. Bei Konzentrationen über 250 µM ß-Peltatin kann eine Substrathemmung beobachtet werden. Als weiteres Produkt der Methylierungsreaktion entsteht S Adenosylhomocystein (SAH), das auch eine Hemmung der POMT-Aktivität bewirkt. Diese Hemmung ist kompetitiv, kann also durch eine höhere Zugabe von SAM wieder aufgehoben werden. Die ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase ist nicht abhängig von Magnesiumionen, wie es Caffeoyl-CoA Methyltransferasen sind. Es können keine Cofaktoren, aber Hemmstoffe der POMT-Aktivität gefunden werden. So hemmt Zinksulfat schon in einer Konzentration von 5 mM die POMT-Aktivität komplett. Auch Eisensulfat und Eisenchlorid hemmen in Konzentrationen von 5 mM die Aktivität bis auf 10 % der Ausgangsaktivität. Für Mangansulfat kann eine Hemmung bis auf 35 % bei Konzentrationen von 10 mM ermittelt werden. Über eine Größenausschlusschromatographie kann eine Größe von ca. 64 kDa ermittelt werden. Wie bei den meisten anderen pflanzlichen Methyltransferasen handelt es sich bei der POMT wahrscheinlich um ein Homodimer. Für die Reinigung der ß-Peltatin 6-O-Methyltransferase kann ein Protokoll ermittelt werden, bei dem eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung in einem Bereich von 40–80 % Ammoniumsulfatsättigung, eine Anionenaustauschchromatographie über Q-Sepharose, eine zweite Ammoniumsulfatfällung bis 80 % Ammoniumsulfatsättigung und eine Affinitäts-chromatographie über SAH-EAH-Sepharose aufeinanderfolgen. Damit kann ein Reinigungs-faktor von 12,6 fach erreicht werden, der Verlust der Aktivität liegt allerdings bei 92 %. Auf einem SDS-Polyacrylamidgel können nur noch wenige Proteinbanden nach der Affinitätschromatographie und damit ein deutlicher Reinigungseffekt gezeigt werden. Die Suspensionskultur von Linum nodiflorum wird über einen Zeitraum von 15 und 20 Tagen in Bezug auf Medienparameter wie Volumen, pH-Wert, Leitfähigkeit, Zuckergehalt und Konzentration an Ammonium, Phosphat und Nitrat beobachtet. Auch die Suspensionszellen können auf Proteingehalt, Enzymaktivität und Entwicklung des Frisch- und Trockengewichts untersucht werden. Aus den Zellen und dem Medium werden Lignane extrahiert und nach Art und Menge bestimmt. Mit degenerierten Primern gegen hochkonservierte Regionen von Methyltransferasen wie der SAM-Bindestelle werden über PCR methyltransferasenspezifische Amplifikate von cDNAs aus 6-Tage alten Zellen von Linum nodiflorum isoliert. Die cDNA-Stücke werden in E. coli einkloniert und nach Datenbankvergleich mittels der RACE-Methode bis zur kompletten Länge verlängert. Dabei wird die Methyltransferase MT 1 gefunden, die ein offenes Leseraster von 1095 Basen, codierend für ein Protein mit 365 Aminosäuren und einem berechneten Molekulargewicht von 39,8 kDa, besitzt. Sie hat bis ca. 80 % Identität mit Kaffeesäure 3-O-Methyltransferasen aus verschiedenen Pflanzenarten. Das vollstänige offene Leseraster der MT1-cDNA wird in den Expressionsvektor pTrc99a ligiert, und das Protein in E. coli JM 109 exprimiert. Das entstehende Protein wird auf Substratspezifität getestet. Dabei wird kein Umsatz von ß-Peltatin gemessen. Das exprimierte Enzym setzt Kaffeesäure und seine Derivate um. Der größte Umsatz kann jedoch mit dem Cumarin Daphnetin gemessen werden. Bei den umgesetzten Substraten kann eine gemeinsame Struktur entdeckt werden, die einen doppelt hydroxylierten Aromaten und einen größeren Rest enthält