Single-Channel Recording of Biological Targets using Surface Modified Nanochannels

The present work describes surface modification techniques used to enhance nanofluidic sensing of biological targets. Nanofluidic sensors enable rapid, label-free sensing of biological targets often with single molecule sensitivity. The high surface-to-volume ratio of these devices encourages surface interactions, often enabling control of the signal transduction. Nanofluidic devices have been fabricated within silicon-based substrates which enable batch processing, compatibility with biological targets, and flexibility in surface modification. Solid-state platform also afford control of the critical dimensions of the nanometric devices. The label-free, conductometric sensing abilities of nanopore devices have potential for single molecule genomic sequencing with long read lengths. The rapid nature of polynucleic acid transport through solid-state nanopores (10 μs/base) have, however, limited the resolution with which adjacent nucleotides can be accurately resolved. The present work has surveyed hydrophobic surface functionalization as a means to reduce DNA translocation velocity within solid-state nanopores. Within these modified nanopores, DNA molecules induced ionic conductance perturbations exceeding the expected amplitude based upon a rigid rod model often used to describe single molecule transport through cylindrical nanopores. Electron energy loss spectroscopy was used to confirm the localized deposition of hydrophobic surface coatings within nanoconfined environments. Affinity binding probes were also used to demonstrate nanofluidic biosensing capability. The streptavidin - biotin bond was used as a model system because of its high binding affinity, fast reaction kinetics, and prevalent use in sandwich assays. Specific capture of the target analyte was demonstrated in both nanopores (nanometric in three dimensions) and nanoslit devices (nanometric in one dimension). Subsequent release and repeat capture was demonstrated, extending the lifetime of the device without cumbersome re-coating steps. Observation of the targeted capture in real-time has been used to further understand signal transduction and reaction kinetics of proteins in nanoconfined environments.Doctor of Philosoph

Fluorescence-based nanofluidic biosensor platform for real-time measurement of protein binding kinetics

L'analyse cinétique d'interactions de protéines offre une multitude d'informations sur les fonctions physiologiques de ces molécules au sein de l'activité cellulaire, et peut donc contribuer à l'amélioration des diagnostics médicaux ainsi qu'à la découverte de nouveaux traitements thérapeutiques. La résonance plasmonique de surface (SPR) est la technique de biodétection optique de référence pour les études cinétiques d'interaction de molécules biologiques. Si la SPR offre une détection en temps réel et sans marquage, elle nécessite en revanche des équipements coûteux et sophistiqués ainsi que du personnel qualifié, limitant ainsi son utilisation au sein de laboratoires de recherche académiques. Dans ces travaux de thèse, nous avons développé une plateforme de biodétection basée sur l'utilisation de nanofentes biofonctionnalisées combinées avec une détection par microscopie à fluorescence. Ce système permet l'observation en temps réel d'interactions protéines-protéines et la détermination des constantes cinétiques associées, avec des temps de réponse optimisés et une excellente efficacité de capture. La fonctionnalité du système a été démontrée par l'étude des cinétiques d'interaction de deux couples modèles de différentes affinités : le couple streptavidine/biotine et le couple IgG de souris/anti-IgG de souris. Une très bonne cohérence entre les constantes cinétiques extraites, celles obtenues par des expériences similaires réalisées en SPR et les valeurs rapportées dans la littérature montre que notre approche pourrait être facilement applicable pour l'étude cinétique d'interactions de protéines avec une sensibilité allant jusqu'au pM, sur une large gamme de constantes de dissociation. De plus, nous avons intégré un générateur de gradient de concentrations microfluidique en amont de nos nanofentes, permettant ainsi des mesures simultanées de cinétiques d'interactions à différentes concentrations d'analyte en une seule expérience. Ce système intégré offre de nombreux avantages, tels qu'une réduction de la consommation des réactifs et des temps d'analyse par rapport aux approches séquentielles classiques. Cette technologie innovante pourrait ainsi être un outil précieux non seulement pour les domaines du biomédical et de la médecine personnalisée mais aussi pour la recherche fondamentale en chimie et biologie.Kinetic monitoring of protein-protein interactions offers fundamental insights of their cellular functions and is a vital key for the improvement of diagnostic tests as well as the discovery of novel therapeutic drugs. Surface plasmon resonance (SPR) is an established biosensor technology routinely used for kinetic studies of biomolecular interactions. While SPR offers the benefits of real-time and label-free detection, it requires expensive and sophisticated optical apparatus and highly trained personnel, thus limiting the accessibility of standard laboratories. In this PhD project, we have developed an alternative and cost-effective biosensor platform exploiting biofunctionalized nanofluidic slits, or nanoslits, combined with a bench-top fluorescence microscope. Our approach enables the visualization of protein interactions in real-time with the possibility to determine associated kinetic parameters along with optimized response times and enhanced binding efficiency. We have demonstrated the effectiveness of our devices through kinetic studies of two representative protein-receptor pairs with different binding affinities: streptavidin-biotin and mouse IgG/anti-mouse IgG interactions. Good agreement of extracted kinetic parameters between our device, SPR measurements and literature values indicated that this approach could be readily applicable to study kinetics of protein interactions with sensitivity down to 1 pM on a large scale of dissociation constants. In addition, we have incorporated a microfluidic gradient generator to our validated nanoslit device, which has allowed one-shot parallel kinetic measurements to be realized in a single-experiment. This integrated system provides advantages of diminished material consumption and analysis time over the conventional kinetic assays. We believe that this innovative technology will drive future advancements not only in the discipline of biomedical and personalized medicine, but also in basic chemical/biological research

Untersuchung der Bindungskinetiken von rekombinantem, humanem knochenmorphogenetischen Protein mit Hilfe der totalen inneren Reflexionsfluoreszenzspektroskopie unter Berücksichtigung des Photobleachings und Fluoreszenzquenchings

Derzeit findet eine intensive Erforschung von Implantaten statt, die zur besseren Einheilung mit rekombinantem, humanem knochenmorpho-genetischen Protein (rhBMP-2) beschichtet sind. Neben der Kenntnis der Sorptionsraten ist von großem Interesse, daß die auf den Implantaten aufgebrachten Stoffe in einer biologisch aktiven Konformation freigesetzt werden. Primäres Ziel der Arbeit war die Ermittlung der kinetischen Konstanten (k+1 und k−1) für die initiale Adsorption von rhBMP-2 an Quarzglas und an Poly-DL-laktid (PDLLA), um daraus die Bindungskonstanten abzuleiten. Ein weiteres Ziel lag im Erhalt von Informationen über Konformations-änderungen des rhBMP-2 auf diesen Oberflächen als Funktion der Ver- weildauer des Proteins auf der Oberfläche. Hierzu wurden Adsorptions- und Desorptionsmessungen an einem TIRF-Rheometer (TIRF: totale innere Reflexionsfluoreszenz) durchgeführt, bei der das Tryptophan bei 280 nm zur Fluoreszenz angeregt wird. Die geringe Eindringungstiefe erfaßt dabei nur die adsorbierten Moleküle auf der Oberfläche und nicht diejenigen in der Bulklösung. Die Transportlimitierung bei der Adsorption wurde beseitigt, indem die Proteinlösung mit einer vorangehenden Luftblase in die Meßzelle eingeleitet wurde. Die Luftblase reduziert die Nernstsche Diffusionsschicht um den Faktor 50 und führt zu exponen-tiellen Kinetiken, die eine mathematische Auswertung erlauben. Es konnte gezeigt werden, daß Photobleaching nur bei Bestrahlungs-zeiten über 100 s die Fluoreszenz signifikant reduziert. Bei langan-dauernden Desorptionsexperimenten (bis 124 h) wurde daher der Einfluß des Photobleachings berücksichtigt, indem Korrekturfaktoren durch den Vergleich mit 125I-markiertem rhBMP-2 ermittelt wurden. Die Fluoreszenz wurde weiterhin durch Fluoreszenzquenching reduziert. Dabei wurde erstmals ein paradoxes Verhalten des Quenchings festgestellt, nämlich eine Abnahme des Fluoreszenzquenchings mit zunehmender Oberflächenbeladung mit Protein. Vermutlich werden bei der initialen hochaffinen Bindung bei geringer Oberflächenbeladung die π-Systeme der endständigen Tryptophanpaare des Dimers so nah aneinander gebracht, daß durch einen strahlungslosen Energietransfer ein starker Fluoreszenzabfall erfolgt. Bei der darauffolgenden nieder-affinen Bindung bei höherer Beladung, ist die Annäherung der Typto-phanpaare nur gering und verursacht einen entsprechend geringeren Fluoreszenzabfall. Nach Berücksichtigung der Quenchfaktoren konnten alle Adsorptionskinetiken an zweifach exponentielle Funktionen angepaßt werden. Die zweifach exponentiellen Adsorptionskinetiken wurden nun für verschiedene Proteinkonzentrationen unter Bestimmung der Anstiege (kobs-Werte) aufgenommen. Aus dem Auftrag der obs k -Werte gegen die Proteinkonzentrationen wurden dann die kinetischen Konstanten (k+1 und k−1) für den Initialkomplex bestimmt. Für die Adsorption von rhBMP-2 an Quarzglas ergaben sich zwei Geschwindigkeitskonstanten der Adsorption (k+1) und der Desorption (k−1), die auf zwei gleichzeitig ablaufende Bindungsreaktionen IA und IB auf Quarzglas hinwiesen. Daraus wurden die zwei Bindungskonstanten KIA´= 4,6 ± 7,4 × 10 6 M-1 und KIB´= 3,2 ± 3,1 × 10 6 M-1 berechnet, die sich jedoch nicht signifikant voneinander unterscheiden. Diese Konstanten wurden durch ein unab- hängiges Experiment mit 125I-markiertem rhBMP-2 überprüft. Aus der Adsorptionsisotherme mit 125I-rhBMP-2 konnte nur die Bindungs-konstante KI´= 2,9 ± 0,5 × 10 6 M-1 ermittelt werden, die jedoch eine gute Übereinstimmung mit beiden Bindungskonstanten zeigt. Für die Adsorption von rhBMP-2 an PDLLA wurde aus der Auftragung die Bindungskonstante KI´= 3,9 ± 2,2 × 10 5 M-1 ermittelt. Da die Streuungen der Konstanten der Nukleations-Komplexe sehr groß sind, ist die gefundene Größenordnung entscheidend. Zur Untersuchung des Einflusses der Verweildauer des Proteins auf der Oberfläche, wurden Desorptionsexperimente durchgeführt. In diesen Experimenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, daß sich das Protein auf der Oberfläche weiter konformationell verändert unter einer Erhöhung der Bindungskonstanten um bis zu 6 Größenordnungen auf KIVA´= 1,4 ± 0,2 × 10 12 M-1 (für die Bindung an Quarzglas) und KIV´= 9,5 ± 1,4 × 10 10 M-1 (für die Bindung an PDLLA). Durch diese Unter-suchungen konnte erstmals die Dynamik eines Proteins während der Adsorption auf einer Oberfläche in verschiedenen kinetischen Stufen erfaßt werden. Diese Stufen entsprechen metastabilen Zuständen in einer Protein-Adsorptions-Desorptions-Hysterese