Speziesspezifische proteomische Aspekte der axonalen Regeneration retinaler Ganglienzellen am Beispiel der Ratte (Rattus norvegicus) und des Affen (Callithrix jacchus)

Die axonale Regeneration im Zentralen Nervensystem (ZNS) ist ein äußerst komplexer Vorgang, der unter natürlichen Bedingungen nicht stattfindet, gleichwohl jedoch prinzipiell möglich ist. So unterliegen axotomierte RGZ der adulten Ratte einem progressiven Degenerationsprozeß, können jedoch nach entsprechender Vorbehandlung und experimentellen Bedingungen partiell regenerieren. Ziel der Regenerationsforschung ist es daher, durch gezielte Modulation bzw. Applikation von Wirkstoffen das Fortschreiten des Zelltodes aufzuhalten und die Neurone zur axonalen Regeneration zu stimulieren. Im Rahmen dieser Dissertation sollten regenerationsassoziierte Proteinexpressionsveränderungen untersucht werden, um ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen und neue Ansatzpunkte zur gezielten Stimulation der Regeneration zu finden. Dazu wurden zunächst Untersuchungen am etablierten Regenerationsmodell der Rattenretina vorgenommen, bei der eine parallel zur konditionierenden Quetschung des ON gesetzte Linsenverletzung zur verstärkten Regeneration führt. Durch morphologische, biochemische und immunhistochemische Analysen konnte gezeigt werden, dass die regenerationsstimulierende Wirkung der Linsenverletzung über andere Signalkaskaden vermittelt wird, als die nach Quetschung. Neben der von anderen Gruppen postulierten Aktivierung von Makrophagen, konnten hier der neurotrophe Faktor bFGF und die alpha-, beta-, und gamma-Kristalline als mögliche Vermittler dieser Effekte bestimmt werden. Neben diesem vorbehandlungsabhängigen Modell der Rattenretina wurde ein spontan regenerierendes System in Form der Affenretina gefunden, etabliert und charakterisiert. Dieses zeigte eine im Vergleich zur Rattenretina höhere Substratspezifität und erlaubte die Untersuchung altersspezifischer Regenerationsvorgänge. Biochemische und immunhistochemische Untersuchungen offenbarten speziesübergreifende Proteomveränderungen infolge axonaler Regenerationsprozesse. So konnten in beiden Modellen die verstärkte Expression eines GAP-43-ähnlichen Proteins in regenerierten Zuständen nachgewiesen werden. Die parallele verstärkte Expression von GFAP demonstrierte eine speziesübergreifende, entscheidende Rolle der Glia für das Regenerationsgeschehen und stand nicht im Widerspruch zu einer erfolgreichen Regeneration. Darüberhinaus zeigten Kristalline in beiden Modellen eine Veränderung ihrer Expression und Lokalisation im Zuge der Regeneration, die ihre fundamentale Bedeutung für diese Prozesse nahelegen. Zur erweiterten Beobachtung der differentiellen Proteinexpression wurde die Technik der 2D-PAGE etabliert und die hochaufgelöste Darstellung des Retinaproteoms optimiert. In Kombination mit MALDI-MS wurde eine Kartierung des Retinaproteoms der Ratte und des Affen vorgenommen. Es wurden 32 (Rattenretina) bzw. 23 Proteine (Affenretina) unterschiedlicher Funktion und Lokalisation identifiziert und Proteomkarten der Retinae beider Spezies als Basis für weitere, nachfolgende Untersuchungen unter variablen Aspekten generiert. Die proteomische Analyse regenerierter und nicht-regenerierter Retinae offenbarte die differentielle Regulation verschiedener Proteine. Bei dem Modell der Rattenretina konnten zwei unter nicht-regenerativen Bedingungen verstärkt exprimierte Proteine als Synaptotagmin I und High mobility group protein-1 (HMG-1) identifiziert werden. Komparative Analysen der 2D-Gele des Affen offenbarten die alters- und regenerationsabhängige Expression mehrerer Proteine, die als Calmodulin, alpha A-Kristallin, Fatty-acid binding protein (FABP) und Cellular retinoic acid bindig protein (CRABP) bestimmt wurden. Aufgrund der bislang bekannten Funktionen dieser Proteine stellen sie interessante Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen dar. Diese Arbeit konnte damit zahlreiche in das Regenerationsgeschehen involvierte Faktoren und daran gekoppelte Signalwege offendecken. Durch die weitere funktionelle Untersuchung dieser Kandidaten, insbesondere der Kristalline, muß ihre Bedeutung für die Regeneration geklärt werden. Die generierten Karten der Retinaproteome von Ratte und Affe stellen die Basis für weitere differentielle Analysen unter variablen Aspekten dar. Durch die Etablierung des neuen Regenerationsmodells der Affenretina und der 2D-PAGE bestehen nun ausgezeichnete Möglichkeiten ein besseres Verständnis regenerationsassoziierter Prozesse und weitere Ansatzpunkte zu ihrer Stimulation zu finden

Speziesspezifische proteomische Aspekte der axonalen Regeneration retinaler Ganglienzellen am Beispiel der Ratte (Rattus norvegicus) und des Affen (Callithrix jacchus)

Die axonale Regeneration im Zentralen Nervensystem (ZNS) ist ein äußerst komplexer Vorgang, der unter natürlichen Bedingungen nicht stattfindet, gleichwohl jedoch prinzipiell möglich ist. So unterliegen axotomierte RGZ der adulten Ratte einem progressiven Degenerationsprozeß, können jedoch nach entsprechender Vorbehandlung und experimentellen Bedingungen partiell regenerieren. Ziel der Regenerationsforschung ist es daher, durch gezielte Modulation bzw. Applikation von Wirkstoffen das Fortschreiten des Zelltodes aufzuhalten und die Neurone zur axonalen Regeneration zu stimulieren. Im Rahmen dieser Dissertation sollten regenerationsassoziierte Proteinexpressionsveränderungen untersucht werden, um ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen und neue Ansatzpunkte zur gezielten Stimulation der Regeneration zu finden. Dazu wurden zunächst Untersuchungen am etablierten Regenerationsmodell der Rattenretina vorgenommen, bei der eine parallel zur konditionierenden Quetschung des ON gesetzte Linsenverletzung zur verstärkten Regeneration führt. Durch morphologische, biochemische und immunhistochemische Analysen konnte gezeigt werden, dass die regenerationsstimulierende Wirkung der Linsenverletzung über andere Signalkaskaden vermittelt wird, als die nach Quetschung. Neben der von anderen Gruppen postulierten Aktivierung von Makrophagen, konnten hier der neurotrophe Faktor bFGF und die alpha-, beta-, und gamma-Kristalline als mögliche Vermittler dieser Effekte bestimmt werden. Neben diesem vorbehandlungsabhängigen Modell der Rattenretina wurde ein spontan regenerierendes System in Form der Affenretina gefunden, etabliert und charakterisiert. Dieses zeigte eine im Vergleich zur Rattenretina höhere Substratspezifität und erlaubte die Untersuchung altersspezifischer Regenerationsvorgänge. Biochemische und immunhistochemische Untersuchungen offenbarten speziesübergreifende Proteomveränderungen infolge axonaler Regenerationsprozesse. So konnten in beiden Modellen die verstärkte Expression eines GAP-43-ähnlichen Proteins in regenerierten Zuständen nachgewiesen werden. Die parallele verstärkte Expression von GFAP demonstrierte eine speziesübergreifende, entscheidende Rolle der Glia für das Regenerationsgeschehen und stand nicht im Widerspruch zu einer erfolgreichen Regeneration. Darüberhinaus zeigten Kristalline in beiden Modellen eine Veränderung ihrer Expression und Lokalisation im Zuge der Regeneration, die ihre fundamentale Bedeutung für diese Prozesse nahelegen. Zur erweiterten Beobachtung der differentiellen Proteinexpression wurde die Technik der 2D-PAGE etabliert und die hochaufgelöste Darstellung des Retinaproteoms optimiert. In Kombination mit MALDI-MS wurde eine Kartierung des Retinaproteoms der Ratte und des Affen vorgenommen. Es wurden 32 (Rattenretina) bzw. 23 Proteine (Affenretina) unterschiedlicher Funktion und Lokalisation identifiziert und Proteomkarten der Retinae beider Spezies als Basis für weitere, nachfolgende Untersuchungen unter variablen Aspekten generiert. Die proteomische Analyse regenerierter und nicht-regenerierter Retinae offenbarte die differentielle Regulation verschiedener Proteine. Bei dem Modell der Rattenretina konnten zwei unter nicht-regenerativen Bedingungen verstärkt exprimierte Proteine als Synaptotagmin I und High mobility group protein-1 (HMG-1) identifiziert werden. Komparative Analysen der 2D-Gele des Affen offenbarten die alters- und regenerationsabhängige Expression mehrerer Proteine, die als Calmodulin, alpha A-Kristallin, Fatty-acid binding protein (FABP) und Cellular retinoic acid bindig protein (CRABP) bestimmt wurden. Aufgrund der bislang bekannten Funktionen dieser Proteine stellen sie interessante Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen dar. Diese Arbeit konnte damit zahlreiche in das Regenerationsgeschehen involvierte Faktoren und daran gekoppelte Signalwege offendecken. Durch die weitere funktionelle Untersuchung dieser Kandidaten, insbesondere der Kristalline, muß ihre Bedeutung für die Regeneration geklärt werden. Die generierten Karten der Retinaproteome von Ratte und Affe stellen die Basis für weitere differentielle Analysen unter variablen Aspekten dar. Durch die Etablierung des neuen Regenerationsmodells der Affenretina und der 2D-PAGE bestehen nun ausgezeichnete Möglichkeiten ein besseres Verständnis regenerationsassoziierter Prozesse und weitere Ansatzpunkte zu ihrer Stimulation zu finden