Circulating microbial RNA and health

© 2015, Nature Publishing Group. All rights reserved. Measurement of health indicators in the blood is a commonly performed diagnostic procedure. Two blood studies one involving extended observations on the health of an individual by integrative Personal Omics Profiling (iPOP), and the other tracking the impact of Left Ventricular Assist Device (LVAD) placement on nine heart failure patients were examined for the association of change in health status with change in microbial RNA species. Decrease in RNA expression ratios of human to bacteria and viruses accompanying deteriorated conditions was evident in both studies. Despite large between-subject variations in bacterial composition before LVAD implantation among all the patients, on day 180 after the implantation they manifested apparent between-subject bacterial similarity. In the iPOP study three periods, namely, pre-respiratory syncytial virus (RSV) infection with normal blood glucose level, RSV infection with normal blood glucose level, and post-RSV infection with high blood glucose level could be defined. The upsurge of Enterobacteria phage PhiX 174 sensu lato and Escherichia coli gene expression, in which membrane transporters, membrane receptors for environment signalling, carbohydrate catabolic genes and carbohydrate-active enzymes were enriched only throughout the second period, which suggests a potentially overlooked microbial response to or modulation of the host blood glucose level.Link_to_subscribed_fulltex

Xenacoelomorpha: The "simple" key to bilaterian ancestry?

Xenacoelomorpha (comprising Xenoturbellida, Acoela and Nemertodermatida) is a clade of marine worms whose position in the tree of life is still in debate. Several phylogenetic analyses have shown them to be placed at the base of all bilaterian animals (e. g. chordates, arthropods) or at a more derived position as sister group to the Ambulacraria (echinoderms and hemichordates) within the Bilateria. A key characteristic is the absence of traits found in other bilaterian animals. Orthogroups are groups of orthologous genes found in several organisms. Orthologues are assumed to retain the same function. These functions would be specific to the clade where an orthogroup is prevalent. I investigate a method to automatically establish and validate orthogroups specific to Bilateria, Protostomia and Deuterostomia. These genes could be relevant for the clades’ respective emergence and differences. These sets will also help to ascertain what genes/functions are absent from Xenacoelomorpha. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules involved in RNA silencing and post-transcriptional regulation of gene expression. MiRNAs have not been extens- ively studied in the Xenaceolomorpha. I introduce a fully automatic miRNA detection pipeline to infer and confirm the existence of pre-miRNA sequences in the genome of Xenoturbella bocki as well as predict miRNA candidates from several xenacoel gen- omes. I report previously undetected miRNA families and opine that previous analyses on Acoelomorpha failed due to loss caused by the higher evolutionary rate when compared to the Xenoturbellida

Antibiotikaresistenz und Pathogenität in den Gram-negativen Bakterien Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella pneumoniae

The dramatic increase of infections caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria is an emerging global problem and possibly one of the greatest challenges of modern medicine. Bacterial pathogens devise various mechanisms to withstand the activity of a wide range of antimicrobial compounds and there is an alarming increase of multi- or even pandrug-resistant isolates. The aims of this thesis were i) to elucidate the molecular mechanisms of fluoroquinolone resistance in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa and ii) to describe the transcriptomic landscape of Klebsiella pneumoniae to correlate gene transcription with the clinical relevant phenotypes of biofilm formation, virulence and antibiotic resistance. In this context, we evaluated the quantitative contributions of quinolone target alteration and efflux pump expression to fluoroquinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa by applying a combination of directed resequencing methods, quantitative real-time PCRs and whole-transcriptome sequencing (RNA-Seq) on a broad and cross-sectional panel of 172 clinical isolates. This comprehensive data showed the role of distinct mutations in the quinolone resistance-determining regions of gyrA and parC. The combination with further mutations (e.g. in gyrB and parE) or enhanced efflux exhibited additive effects Furthermore, we exploited the power of deep transcriptome profiling by RNA-seq to shed light on the transcriptomic landscape of 37 clinical K. pneumoniae isolates of diverse phylogenetic origin. We identified a large set of 3346 genes which were expressed in all isolates. While these core-transcriptome profiles were largely homogenous among isolates of the same sequence type, they varied substantially between groups of different sequence types. This detailed information on differentially expressed genes was linked with the clinically relevant phenotypes of biofilm formation, bacterial virulence and antibiotic resistance. This allowed the identification of a low biofilm-specific gene expression profile within the group of ST258 isolates, the dominant clonal lineage associated with KPC-carbapenemase spread, as a sequence type-specific trait. Moreover, the analysis revealed that antimicrobial resistance in this panel of clinical isolates can be explained by the occurrence of only a few dominant resistance determinants.Der dramatische Anstieg von Infektionen durch multiresistente, gramnegative Bakterien ist ein weltweites Problem, welches möglicherweise eine der größten Herausforderungen moderner Medizin darstellt. Bakterielle Krankheitserreger besitzen verschiedenste Mechanismen, um der Aktivität einer Vielzahl antimikrobieller Verbindungen zu widerstehen und zeigen eine alarmierende Zunahme von multi- oder sogar pan-resistenten Isolaten. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren i) die molekularen Mechanismen der Fluorchinolonresistenz im opportunistischen Erreger Pseudomonas aeruginosa zu erklären und ii) die generelle Genexpression von Klebsiella pneumoniae zu beschreiben und mit den klinisch relevanten Phänotypen der Biofilmbildung, Virulenz und Antibiotikaresistenz zu korrelieren. In diesem Zusammenhang untersuchten wir den quantitativen Einfluss von Mutationen und Veränderung der Expression von Effluxpumpen auf die Fluorchinolonresistenz in Pseudomonas aeruginosa durch eine Kombination von Resequenzierung, quantitativer realtime-PCR und Transkriptom-Sequenzierung (RNA-Seq) anhand einer Sammlung von 172 klinischen Isolaten. Diese umfassenden Daten zeigten die dominierende Rolle bestimmter Mutationen in gyrA und parC, während die Kombination mit weiteren Mutationen (zum Beispiel in gyrB und parE) oder verstärkter Efflux zwar eine additive Wirkung hatte, aber höchstwahrscheinlich nicht zum hohen Resistenzniveau in der Klinik beiträgt. Darüber hinaus nutzen wir die Möglichkeiten hoch-auflösenden Transkriptom-Profilings mittels RNA-Seq um die generelle Gentranskription 37 klinischer K. pneumoniae Isolate unterschiedlichster Herkunft aufzuklären und identifizierten eine große Anzahl von 3346 Genen, die in allen Isolaten exprimiert wurden. Während dieses Kern-Transkriptom weitgehend homogen zwischen Isolaten des gleichen Sequenztypen war, variierte es deutlich zwischen Gruppen unterschiedlicher Sequenztypen. Diese detaillierten Informationen über differentiell exprimierte Gene wurde mit den klinisch relevanten Phänotypen der Biofilmbildung, bakterieller Virulenz und Antibiotikaresistenz verknüpft. Dieses erlaubte die Identifizierung eines Biofilm-spezifischen Genexpressionsprofil in der Gruppe der ST258-Isolate, welche hauptverantwortlich für die Verbreitung der KPC-Carbapenemase sind, als ein Sequenztyp-spezifisches Merkmal. Außerdem ergab die Analyse, dass die Antibiotikaresistenz durch das Auftreten nur weniger, dominanter Resistenzdeterminanten erläutert werden kann

The last steps of the alternative heme biosynthesis in Archaea: Characterization of the proteins AhbA, AhbB, AhbC and the Radical SAM enzyme AhbD from Methanosarcina barkeri

Das zyklische Tetrapyrrol Häm ist für nahezu alle Lebewesen essentiell. In Eukaryoten wird Häm über einen Syntheseweg generiert, der seit längerem charakterisiert ist. In Sulfat-reduzierenden Bakterien sowie allen Häm produzierenden Archaea wurde ein alternativer Häm-Biosyntheseweg entdeckt. Dieser führt über die Intermediate Precorrin-2, Sirohydrochlorin, Sirohäm (SH), 12,18-Didecarboxysirohäm (DDSH) und Fe Coproporphyrin III (Fe-Copro III). In dieser Arbeit wurden die alternativen Häm-Biosyntheseproteine AhbAB, AhbC und AhbD aus dem methanogenen Archeon Methanosarcina barkeri funktionell charakterisiert. Durch in-vivo-Enzymtests konnte gezeigt werden, dass AhbA und AhbB (Mbar_A1459 und Mbar_A1460) SH zu DDSH umsetzen. AhbAB liegt als heterodimerer Komplex vor, der das Endprodukt Häm bindet und könnte daher an einem regulatorischen feedback-Inhibitionsmechanismus beteiligt sein. Ebenfalls wurde in vivo gezeigt, dass AhbC (Mbar_A1793) Fe-Copro III generiert. Rekombinant produziertes AhbD (Mbar_1458) aus M. barkeri wurde erfolgreich gereinigt und bindet zwei [4Fe 4S]-Cluster. Eine Umsetzung von Fe-Copro III zu Häm durch AhbD wurde in in vitro-Enzymtests erfolgreich nachgewiesen. Da es zu den Radical SAM (RS) Enzymen gehört, startet seine Katalyse durch Spaltung von S Adenosylmethionin (SAM) an einem der beiden [4Fe 4S]-Cluster zu einem 5‘-Deoxyadenosyl-Radikal. Durch Generierung von AhbD-Varianten, bei denen entweder die N-terminale bzw. die C-terminale Clusterbindung aufgehoben wurde, konnte durch SAM-Spaltungstests das N terminale Cluster in Anwesenheit von Fe-Copro III als RS-Cluster identifiziert werden. Das zusätzliche C terminale Cluster des AhbD konnte durch ESR- und CV-Messungen ebenfalls als redoxaktives Cluster identifiziert werden, was eine Rolle dieses Clusters für den Elektronentransfer bei einem späteren Reaktionsschritt wahrscheinlich macht. Substratbindungstests sowie Enzymtests mit Substratanaloga zeigten, dass keines der Cluster für die Substratbindung essentiell ist, jedoch das zentrale Metallatom des Substrates für die vollständige Bildung des Produkts von Bedeutung ist. Weiterhin wurde das AhbD-Homolog aus Metallosphaera sedula (Msed_0512) erfolgreich gereinigt und kristallisiert, wobei erste hexagonale kristalline Strukturen beobachtet wurden.The cyclic tetrapyrrole heme is essential for almost all living organisms. In eukaryotes heme is synthesized via a well-characterized pathway. An alternative pathway was found to be operative in sulfate-reducing bacteria and all heme-producing Archaea. In this pathway the intermediates precorrin-2, sirohydrochlorin, siroheme (SH), 12,18-didecarboxysiroheme (DDSH) and iron-coproporphyrin III (Fe-copro III) are formed, which are not part of the classical heme biosynthesis route. In this work, the alternative heme biosynthesis proteins from the methanogenic archeon Methanosarcina barkeri AhbAB, AhbC and AhbD were functionally characterized. In vivo enzyme assays showed, that AhbA and AhbB (Mbar_A1459 and Mbar_A1460) convert SH into DDSH. AhbAB form a heterodimeric complex, which is able to bind the end-product heme. Thus, a role for AhbAB in a regulatory feedback mechanism might be possible. Further, AhbC (Mbar_A1793) was shown to catalyze the conversion of DDSH into Fe copro III in vivo. Recombinantly produced AhbD (Mbar_1458) from M. barkeri was purified indicating the binding of two [4Fe 4S] clusters. The conversion of Fe-copro III into heme by the action of AhbD was confirmed by in vitro enzyme assays. AhbD belongs to the Radical SAM (RS) enzymes and its catalysis starts with the cleavage of S adenosylmethionine (SAM) into a 5‘ deoxyadenosyl radical at one of the [4Fe 4S] clusters. By generation of cluster variants, which are able to bind either the N terminal or the C-terminal cluster, the N-terminal cluster was identified as the only Radical cluster in AhbD using SAM cleavage assays with Fe copro III. The auxilliary C-terminal cluster was shown to be redox-active with EPR and CV measurements. Since it is also essential for the enzyme’s overall activity these measurements indicated a role for the cluster in electron transfer. Studies for substrate binding and enzyme assays using substrate analogs showed, that the cluster is not essential for substrate binding. The central metal ion of the substrate is important for a complete conversion of substrate. Additionally, the homolog of AhbD from Metallosphaera sedula (Msed_0512) was also purified and crystallized. First crystal-like hexagonal structures were obtained for the first time

The last steps of the alternative heme biosynthesis in Archaea: Characterization of the proteins AhbA, AhbB, AhbC and the Radical SAM enzyme AhbD from Methanosarcina barkeri

Das zyklische Tetrapyrrol Häm ist für nahezu alle Lebewesen essentiell. In Eukaryoten wird Häm über einen Syntheseweg generiert, der seit längerem charakterisiert ist. In Sulfat-reduzierenden Bakterien sowie allen Häm produzierenden Archaea wurde ein alternativer Häm-Biosyntheseweg entdeckt. Dieser führt über die Intermediate Precorrin-2, Sirohydrochlorin, Sirohäm (SH), 12,18-Didecarboxysirohäm (DDSH) und Fe Coproporphyrin III (Fe-Copro III). In dieser Arbeit wurden die alternativen Häm-Biosyntheseproteine AhbAB, AhbC und AhbD aus dem methanogenen Archeon Methanosarcina barkeri funktionell charakterisiert. Durch in-vivo-Enzymtests konnte gezeigt werden, dass AhbA und AhbB (Mbar_A1459 und Mbar_A1460) SH zu DDSH umsetzen. AhbAB liegt als heterodimerer Komplex vor, der das Endprodukt Häm bindet und könnte daher an einem regulatorischen feedback-Inhibitionsmechanismus beteiligt sein. Ebenfalls wurde in vivo gezeigt, dass AhbC (Mbar_A1793) Fe-Copro III generiert. Rekombinant produziertes AhbD (Mbar_1458) aus M. barkeri wurde erfolgreich gereinigt und bindet zwei [4Fe 4S]-Cluster. Eine Umsetzung von Fe-Copro III zu Häm durch AhbD wurde in in vitro-Enzymtests erfolgreich nachgewiesen. Da es zu den Radical SAM (RS) Enzymen gehört, startet seine Katalyse durch Spaltung von S Adenosylmethionin (SAM) an einem der beiden [4Fe 4S]-Cluster zu einem 5‘-Deoxyadenosyl-Radikal. Durch Generierung von AhbD-Varianten, bei denen entweder die N-terminale bzw. die C-terminale Clusterbindung aufgehoben wurde, konnte durch SAM-Spaltungstests das N terminale Cluster in Anwesenheit von Fe-Copro III als RS-Cluster identifiziert werden. Das zusätzliche C terminale Cluster des AhbD konnte durch ESR- und CV-Messungen ebenfalls als redoxaktives Cluster identifiziert werden, was eine Rolle dieses Clusters für den Elektronentransfer bei einem späteren Reaktionsschritt wahrscheinlich macht. Substratbindungstests sowie Enzymtests mit Substratanaloga zeigten, dass keines der Cluster für die Substratbindung essentiell ist, jedoch das zentrale Metallatom des Substrates für die vollständige Bildung des Produkts von Bedeutung ist. Weiterhin wurde das AhbD-Homolog aus Metallosphaera sedula (Msed_0512) erfolgreich gereinigt und kristallisiert, wobei erste hexagonale kristalline Strukturen beobachtet wurden.The cyclic tetrapyrrole heme is essential for almost all living organisms. In eukaryotes heme is synthesized via a well-characterized pathway. An alternative pathway was found to be operative in sulfate-reducing bacteria and all heme-producing Archaea. In this pathway the intermediates precorrin-2, sirohydrochlorin, siroheme (SH), 12,18-didecarboxysiroheme (DDSH) and iron-coproporphyrin III (Fe-copro III) are formed, which are not part of the classical heme biosynthesis route. In this work, the alternative heme biosynthesis proteins from the methanogenic archeon Methanosarcina barkeri AhbAB, AhbC and AhbD were functionally characterized. In vivo enzyme assays showed, that AhbA and AhbB (Mbar_A1459 and Mbar_A1460) convert SH into DDSH. AhbAB form a heterodimeric complex, which is able to bind the end-product heme. Thus, a role for AhbAB in a regulatory feedback mechanism might be possible. Further, AhbC (Mbar_A1793) was shown to catalyze the conversion of DDSH into Fe copro III in vivo. Recombinantly produced AhbD (Mbar_1458) from M. barkeri was purified indicating the binding of two [4Fe 4S] clusters. The conversion of Fe-copro III into heme by the action of AhbD was confirmed by in vitro enzyme assays. AhbD belongs to the Radical SAM (RS) enzymes and its catalysis starts with the cleavage of S adenosylmethionine (SAM) into a 5‘ deoxyadenosyl radical at one of the [4Fe 4S] clusters. By generation of cluster variants, which are able to bind either the N terminal or the C-terminal cluster, the N-terminal cluster was identified as the only Radical cluster in AhbD using SAM cleavage assays with Fe copro III. The auxilliary C-terminal cluster was shown to be redox-active with EPR and CV measurements. Since it is also essential for the enzyme’s overall activity these measurements indicated a role for the cluster in electron transfer. Studies for substrate binding and enzyme assays using substrate analogs showed, that the cluster is not essential for substrate binding. The central metal ion of the substrate is important for a complete conversion of substrate. Additionally, the homolog of AhbD from Metallosphaera sedula (Msed_0512) was also purified and crystallized. First crystal-like hexagonal structures were obtained for the first time