Characterization of nuclear factor-kappaB binding sites in the freshwater snail, Biomphalaria glabrata

Biomphalaria glabrata is an intermediate snail host for the digenean trematode, Schistosoma mansoni, which causes the human disease schistosomiasis. A lot of research has focused on the snail-schistosome interaction, especially in regards to the immune response of the snail. The nuclear factor-kappaB (NF-κB) pathway, which is involved in regulating the immune response, can be triggered by the Toll-like receptor (TLR) signaling pathway. However, not much is known about the specific molecular mechanisms regulating these responses. Both NF-κB and TLR homologues have recently been reported in B. glabrata so it is of great interest to determine if BgNF-κB can regulate components of the pathway. We have used bioinformatics to identify putative κB sites upstream of 16 genes coding for members of the TLR pathway in B. glabrata. In order to determine if the snail’s NF-κB p65 protein can recognize the κB sites of interest, electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) were carried out. The functional analyses of putative κB sites are essential for advancing our understanding of the TLR mediated NF-κB pathway in B. glabrata. In the present study, six novel κB sites were characterized by showing that the Rel homology domain (RHD) of the B. glabrata NF-κB p65 protein could bind to these κB sites. Our findings suggest that BgNF-κB can regulate the expression of these genes

MULTIVARIATE ANALYSIS TO IDENTIFY POTENTIAL BIOMARKERS FOR PROGNOSIS AND TREATMENT RESISTANCE IN HEAD AND NECK CANCER PATIENTS

It is estimated that nearly 50,000 individuals in the United States will be diagnosed with head and neck cancer in 2017 (American Cancer Society www.cancer.org). Ninety percent of oral cancers are head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Major obstacles in the treatment of HNSCC are recurrence and treatment resistance, which contributes to increased mortality. Therefore, there is increased need to determine genetic alterations in HNSCC that may be ideal novel drug targets, and biomarkers to improve diagnostic and prognostic testing. Abnormal localization and overexpression of base excision repair protein and transcriptional regulator Apurinic/Apyrimidic endonuclease (APE1) has been associated with treatment resistance and poor prognosis. Therefore, we explored mechanisms for how APE1 contributes to treatment resistance and increased mortality in HNSCC. Because oxidative stress heavily influences APE1’s expression and transcriptional regulatory activities, we examined genes involved in oxidative stress management, including SOD3 and NRF2. PPARGC1A, a NRF2 transcriptional co-activator, was also examined as our lab previously observed a link between APE1 and PPARGC1A expression. This previous work also revealed that APE1 suppressed gene expression of tumor suppressor, decorin (DCN). To examine possible mechanisms for how APE1 regulates expression of tumor suppressors and antioxidants, digital image analysis of immunohistochemistry staining was used to identify alterations in protein expression. Nuclear and total cellular protein expression of APE1, DCN, NRF2, PPARGC1A, and SOD3 were quantified in regions of proximal benign, carcinoma in situ (CIS) and invasive HNSCC. Patient survival analysis revealed that increased APE1, DCN, and PPARGC1A protein levels were significantly associated with reduced survival in CIS, benign, and invasive tissues respectively. Using multivariate analysis of protein expression, we identified that increased APE1 protein levels in the CIS of primary tumors were associated with the presence of cancer invaded lymph nodes. Elevated DCN and SOD3 protein levels in benign tissue were associated with poorly differentiated tumors as was reduced PPARGC1A in CIS. Most importantly, potential prognostic biomarkers for use in early cancer development were identified. Identifying poor prognosis in early cancer development allows the possibility of improved treatment strategies, which could prevent invasive cancer development, and increase patient survival

Studio della regolazione trascrizionale della Stearoyl-CoA Desaturase 1 (SCD1) in Cellule Staminali Tumorali di adenocarcinoma del polmone

Le Cellule Staminali Tumorali (CSCs) rappresentano una sottopopolazione di cellule tumorali in grado di auto-rinnovarsi differenziandosi. Recenti evidenze suggeriscono che Stearoyl-CoA-desaturasi 1 (SCD1), enzima coinvolto nella sintesi degli acidi grassi monoinsaturi a partire dagli acidi grassi saturi, ha un ruolo in diverse neoplasie. Il gruppo di Ricerca studia da anni il ruolo di SCD1 nel tumore al polmone, il presente lavoro approfondisce gli aspetti legati alla sopravvivenza e alla propagazione delle CSCs confinando il sistema biologico all’adenocarcinoma polmonare. Nella prima parte della trattazione sono state utilizzate le linee primarie derivanti da versamento pleurico di adenocarcinoma del polmone, al fine di studiare gli effettori del pathway di Hippo, YAP e TAZ. In seguito all’inibizione di SCD1, le cellule 3D mostrano una riduzione di YAP/TAZ. La regolazione di YAP/TAZ da parte di SCD1 dipende anche dall'attività di β-catenina, poiché è stato dimostrato che la downregolazione di YAP/TAZ, indotta dal blocco di SCD1, può essere revertita con l'aggiunta del ligando esogeno. Affinché ci sia attivazione di SCD1 e di YAP/TAZ è necessario che il complesso di distruzione di β-catenina sia inattivo. In linea con i risultati in vitro, l'analisi immunoistochimica dei campioni di adenocarcinoma polmonare ha mostrato che i livelli di espressione di SCD1 co-variano con quelli di β-catenina e YAP/TAZ. I set di dati di espressione genica hanno permesso di osservare che gli elevati livelli di co-espressione di SCD1, β-catenina, YAP/TAZ e dei geni target hanno un forte valore prognostico negativo nell'adenocarcinoma polmonare. Infine, le analisi bioinformatiche, volte a identificare quali combinazioni geniche hanno avuto effetti sinergici sull'outcome clinico, hanno mostrato che una scarsa sopravvivenza è associata ad alta co-espressione di SCD1, β-catenina e YAP/TAZ e del gene target, birc5. Il recente lavoro pubblicato dimostra per la prima volta il coinvolgimento di SCD1 nella regolazione del pathway di Hippo nell’adenocarcinoma del polmone, e propone il metabolismo degli acidi grassi come regolatore chiave delle CSCs (Noto et al., 2017). Nella seconda parte del lavoro di Dottorato, lo studio approfondisce il meccanismo trascrizionale responsabile della regolazione di SCD1 nelle CSCs. Quindi, l’attenzione si è focalizzata sullo studio del promotore del gene SCD1. L’analisi bioinformatica è stata effettuata al fine di individuare i putativi siti di legame dei Fattori Trascrizionali implicati nella sua regolazione. I Fattori Trascrizionali identificati mediante analisi bioinformatica sono: Sterol-Regulated-Element-Binding-1 (SREPB-1), c-MYC, Fattore Nucleare Y (-YA e -YB) e il Fattore Nucleare kB (NF- kB). Sono state determinate le porzioni di arricchimento dei suddetti Fattori Trascrizionali mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-qPCR) nella regione di interesse del promotore. Dai risultati emerge che, il passaggio da cellule cresciute in condizioni di aderenza a sferoidi, presenta un importante arricchimento dei siti di legame dei Fattori Trascrizionali sul promotore di SCD1. Al fine di identificare i Fattori Trascrizionali che assumono importanza direttamente o indirettamente nelle CSCs, è stato effettuato il silenziamento genico per valutare se l’inibizione dell’attività possa esser riflessa sull’espressione di SCD1. Infatti, la regolazione di SCD1 in CSCs è influenzata dalla presenza di SREPB1 e NF-Y. Considerando i risultati ottenuti, l’obiettivo è stato quello di effettuare la mutagenesi sul promotore di SCD1, mediante il sistema CRISPR/Cas9 per ottenere dei cloni stabili che indicassero la porzione di promotore efficiente nella regolazione trascrizionale di SCD1 in CSCs. La generazione del clone PR_1Δ, in seguito a saggi funzionali, mostra una diminuzione dell’espressione di SCD1 e una ridotta capacità di formazione di cellule in 3D, poichè è stata deleta la porzione in cui sono presenti i siti di legame di SREBP1 e c-MYC e NF-kB. In futuro verranno approfondite le analisi di genomica funzionale del trascrittoma e di accessibilità della cromatina, sia circostanziate al promotore di SCD1 che ampliate nelle CSCs. Le informazioni che ne deriveranno ci permetteranno di rafforzare le informazioni e le terapie verso l’adenocarcinoma del polmone