Identificación in silico y evaluación in vitro de un péptido dirigido a interactuar con la proteína ROP5 de Toxoplasma gondii RH drivado de la proteína IRGb2-b1-CIM

INTRODUCCIÓN: T. gondii ha desarrollado varias estrategias para evadir las respuestas inmunes en sus muchos hospedadores, siendo la proteína ROP5 junto con ROP18 factores de virulencia que bloquean los mecanismos inmunes innatos activados por IFN-γ en células de ratón como las proteínas IRG. De hecho, ROP5B se une a IRGa6 para alterar su estructura y exponer residuos que son fosforilados por ROP18, lo que lleva a su inhibición. Se ha demostrado que los ratones de la India de una cepa llamada CIM pueden resistir la infección con parásitos RH virulentos, y este fenotipo se asoció a la proteína en tándem altamente polimórfica IRGb2-b1. Se ha sugerido que la hélice 4 de IRGb2-CIM, una estructura homóloga a la hélice de IRGa6, también sería la responsable de interactuar con ROP5B. Se desconoce si un péptido derivado de la hélice 4 de IRGb2-CIM podría reproducir la función natural de la proteína IRGb2-b1-CIM y disminuir de la misma manera la replicación del parásito. El objetivo del estudio fue identificar in silico un péptido derivado de la proteína IRGb2-b1-CIM dirigido a interactuar con la proteína ROP5 de Toxoplasma gondii RH y evaluar su efecto en el crecimiento y la viabilidad in vitro del parásito. METODOLOGÍA: Se utilizó un software en MATLAB para realizar un análisis de tiempo-frecuencia e identificar patrones energéticos que estuviesen en una misma frecuencia en IRGa6-BL/6 y en IRGb2-CIM en regiones correspondientes a sus hélices 4 y así identificar los aminoácidos responsables de la posible interacción de IRGb2-b1-CIM con ROP5B y derivar de allí el péptido. Luego, se obtuvo un modelo del acoplamiento molecular entre el péptido y ROP5B para describir las posibles interacciones que se podrían generar. Posteriormente, se evaluó el efecto citotóxico en células iMEF-BL/6 mediante el ensayo de reducción de MTT, incubando las células durante 24 horas con concentraciones del péptido que iban desde 5 μM hasta 150 μM. Para evidenciar la captación en células iMEF-BL/6, se incubaron las células durante 4 horas con 50 μM del péptido y mediante inmunofluorescencia indirecta usando como anticuerpo primario anti-TAT-AF594 y como anticuerpo secundario donkey-anti-rabbit-IgG-AF488. Se evaluó 3 la interacción del péptido con ROP5B mediante una ELISA tipo sándwich usando un anticuerpo de captura anti-ROP5 y dos anticuerpos de detección anti-TAT-AF594 y anti-Conejo-HRP. Se midió el efecto en la replicación del parásito en células iMEF-BL/6, incubando 50 μM del péptido con células previamente estimuladas con IFN-γ y posteriormente infectando las células con parásitos RH-YFP para comparar los niveles de fluorescencia con las células sin péptido. Por último, se midió el efecto en la infección del parásito incubando e infectando al mismo tiempo las células iMEF-BL/6 con 50 μM del péptido y parásitos RH-YFP para comparar los niveles de fluorescencia con las células sin péptido. RESULTADOS: Se identificó un péptido de 20 aa derivado de la hélice 4 de IRGb2-CIM a través del análisis de tiempo-frecuencia que podría interactuar en una región próxima en la cual interactúa IRGa6 con ROP5B. El péptido no tuvo efecto citotóxico al no disminuir la viabilidad metabólica de las células iMEF-BL/6 luego de 24 horas de incubación. Este péptido tuvo un uptake homogéneo en las células iMEF-BL/6, y se detectó la interacción con ROP5 mediante la ELISA tipo sándwich. El péptido redujo la replicación del parásito (*P = 0.0374) luego de haberse incubado 4 horas en células iMEF-BL/6 estimuladas con IFN-γ y que se infectaron durante 24 horas con los parásitos. Por otro lado, el péptido no redujo la infección del parásito luego de incubar e infectar simultáneamente durante 1.5 y 2 horas. CONCLUSIONES: El software de análisis de tiempo-frecuencia predijo un péptido de 20 aa responsables de la posible interacción ROP5B/IRGb2-CIM y reprodujo la interacción ROP5B/IRGa6. El péptido no es citotóxico en células iMEF-BL/6 con concentraciones desde 5 μM hasta 150 μM y mostró internalización homogénea en dichas células. El péptido puede interactuar de una manera dependiente de la concentración con ROP5. El péptido disminuyó la replicación del parásito, pero no la infección en células iMEF-BL/6.1. Introducción ............................................................................ 8 2. Objetivos ................................................................................. 11 3. Antecedentes y marco teórico ................................................ 20 4. Materiales y métodos ............................................................. 21 5. Resultados ............................................................................. 29 6. Discusión ............................................................................... 45 7. Conclusiones .......................................................................... 51 8. Aspectos bioéticos .................................................................. 52MaestríaMagíster en Ciencias Biomédica