Metabolic engineering of the purine biosynthetic pathway in Corynebacterium glutamicum results in increased intracellular pool sizes of IMP and hypoxanthine

Background: Purine nucleotides exhibit various functions in cellular metabolism. Besides serving as building blocks for nucleic acid synthesis, they participate in signaling pathways and energy metabolism. Further, IMP and GMP represent industrially relevant biotechnological products used as flavor enhancing additives in food industry. Therefore, this work aimed towards the accumulation of IMP applying targeted genetic engineering of Corynebacterium glutamicum. Results: Blocking of the degrading reactions towards AMP and GMP lead to a 45-fold increased intracellular IMP pool of 22 mumol gCDW-1. Deletion of the pgi gene encoding glucose 6-phosphate isomerase in combination with the deactivated AMP and GMP generating reactions, however, resulted in significantly decreased IMP pools (13 mumol gCDW-1). Targeted metabolite profiling of the purine biosynthetic pathway further revealed a metabolite shift towards the formation of the corresponding nucleobase hypoxanthine (102 mumol gCDW-1) derived from IMP degradation. Conclusions: The purine biosynthetic pathway is strongly interconnected with various parts of the central metabolism and therefore tightly controlled. However, deleting degrading reactions from IMP to AMP and GMP significantly increased intracellular IMP levels. Due to the complexity of this pathway further degradation from IMP to the corresponding nucleobase drastically increased suggesting additional targets for future strain optimization

Metabolic response of Geobacter sulfurreducens towards electron donor/acceptor variation

Background Geobacter sulfurreducens is capable of coupling the complete oxidation of organic compounds to iron reduction. The metabolic response of G. sulfurreducens towards variations in electron donors (acetate, hydrogen) and acceptors (Fe(III), fumarate) was investigated via 13C-based metabolic flux analysis. We examined the 13C-labeling patterns of proteinogenic amino acids obtained from G. sulfurreducens cultured with 13C-acetate. Results Using 13C-based metabolic flux analysis, we observed that donor and acceptor variations gave rise to differences in gluconeogenetic initiation, tricarboxylic acid cycle activity, and amino acid biosynthesis pathways. Culturing G. sulfurreducens cells with Fe(III) as the electron acceptor and acetate as the electron donor resulted in pyruvate as the primary carbon source for gluconeogenesis. When fumarate was provided as the electron acceptor and acetate as the electron donor, the flux analysis suggested that fumarate served as both an electron acceptor and, in conjunction with acetate, a carbon source. Growth on fumarate and acetate resulted in the initiation of gluconeogenesis by phosphoenolpyruvate carboxykinase and a slightly elevated flux through the oxidative tricarboxylic acid cycle as compared to growth with Fe(III) as the electron acceptor. In addition, the direction of net flux between acetyl-CoA and pyruvate was reversed during growth on fumarate relative to Fe(III), while growth in the presence of Fe(III) and acetate which provided hydrogen as an electron donor, resulted in decreased flux through the tricarboxylic acid cycle. Conclusions We gained detailed insight into the metabolism of G. sulfurreducens cells under various electron donor/acceptor conditions using 13C-based metabolic flux analysis. Our results can be used for the development of G. sulfurreducens as a chassis for a variety of applications including bioremediation and renewable biofuel production

Metabolic studies on Schizosaccharomyces pombe for improved protein secretion

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is an attractive host for heterologous protein secretion but currently still too little developed to compete against industrial cell factories like Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae. Thus, the present work aimed at increasing the understanding of the metabolism of S. pombe and the metabolic burden associated with protein secretion in order to derive metabolic engineering strategies for improving recombinant protein production. In the first part a system of small-scale parallel bioreactors was constructed to perform studies in continuous culture. This system was used for quantitative metabolic analyses applying 13C-based metabolic flux analysis to S. pombe grown on mixtures of glycerol and acetate compared to respiratory growth on glucose as sole carbon source. Next the methttp://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/incoming/2014/5760/abolic burden of protein secretion was investigated, using strains secreting the model protein maltase in varying amounts up to 27 mg per g cells. Quantitative analysis of the metabolic fluxes and the macromolecular cell composition revealed that lipid biosynthesis, TCA cycle and supply of mitochondrial NADPH as bottlenecks in protein secretion. From these data, a feeding strategy was derived for supplementing the media with acetate and glycerol, which enabled the cells to overcome these limitations. The results were transferred to heterologous secretion of GFP and a single-chain antibody fragment, increasing yields 2-fold and 4-fold, respectively.Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe stellt ein attraktives System zur heterologen Proteinsekretion dar, kann derzeit aber noch nicht mit Zellfabriken wie Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae konkurrieren. Diese Arbeit sollte daher das Verständnis des Metabolismus von S. pombe und dessen Belastung durch Sekretion von Proteinen vergrößern, um Strategien für das Metabolic Engineering abzuleiten, welche die rekombinanten Proteinproduktion verbessern. Zunächst wurde ein System paralleler Bioreaktoren aufgebaut, um Studien in kontinuierlicher Kultur durchzuführen. In diesem System wurden quantitative metabolische Analysen an S. pombe mittels 13C basierter metabolischer Flussanalyse auf Gemischen aus Glycerin und Acetat durchgeführt und mit dem respirativen Wachstum auf Glucose verglichen. Weiter wurde die Belastung des Metabolismus durch Sekretion des Modellproteins Maltase untersucht. Eine quantitative Analyse der metabolischen Flüsse und der makromolekularen Zellzusammensetzung zeigte, dass die Lipid-Biosynthese, der Citratzyklus und die Bereitstellung von mitochondriellem NADPH Engpässe in der Proteinsekretion darstellen. Hieraus wurden Fütterungsstrategien abgeleitet und das Medium mit Acetat und Glycerin supplementiert, wodurch diese Limitierungen überwunden werden konnten. Diese Strategien wurden auf die heterologe Sekretion von GFP und einem Antikörper-Fragment übertragen, wodurch deren Ausbeuten um das 2-fache und 4-fache gesteigert werden konnten

Metabolic network activity characterization using mass spectrometric methods

Innovative methods were developed for metabolic network activity characterization using mass spectrometry. Metabolic flux analysis (MFA) and kinetics of metabolic networks were developed and applied to Corynebacterium glutamicum. A protocol to determine metabolic fluxes at low degree of labelling using gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry (GC-C-IRMS) by the measurement of 13C enrichment in proteinogenic amino acid hydrolyzates was described. Kinetic isotope effects played an increasing role at low degree of labeling but could be corrected. From these corrected 13C enrichments In vivo fluxes in the central metabolism were determined by numerical optimization. The GC-C-IRMS-based method involving low labeling degree of expensive tracer substrate, e.g. 1%, is therefore promising for larger laboratory and industrial pilot scale fermentations. Permeabilization of Corynebacterium glutamicum cells was investigated and optimized. Permeabilized cells are considered closer to the in-vivo situation than purified enzyme(s) for the study of kinetics. A novel strategy was developed for the determination of in-situ enzymatic network kinetics combining permeabilization and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of—flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) quantification. Quantification of small molecular mass metabolites in glycolysis and pentose-phosphate pathway using MALDI-TOF-MS with [U-13C6] glucose-6-phosphate as single internal standard was established. Signal suppression during MALDI analysis could be compensated by applying the standard addition method. Adding selected substrates and cofactors, kinetics of glycolysis and pentose-phosphate pathways were be characterized using this method.Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Massenspektrometrie-basierte Methoden zur Charakterisierung der Aktivität metabolischer Netzwerke entwickelt, die zur Flussanalyse in metabolischen Netzwerken sowie zur Analyse der Kinetik metabolischer Netzwerke angewendet wurden. Die Methode zur Bestimmung metabolischer Flüsse basiert auf der Messung der 13C-Anreicherung in Aminosäuren von Proteinhydrolysaten mit Hilfe von GC-C-IRMS (gas-chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry). Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Bestimmung metabolischer Flüsse auch bei sehr geringen Mengen an 13C-markiertem Substrat möglich ist. Durch Messung der 13C-Anreicherung in Aminosäuren und Korrektur von Isotopen-Effekten sowie durch Anpassung der korrigierten Daten mit Hilfe numerischer Optimierungen, konnten in vivo Flussverteilungen im Zentralstoffwechsel bestimmt werden. Da bei der GC-C-IRMS basierten Methode nur sehr geringe Mengen an relativ teurem 13C markiertem Substrat benötigt werden (~1%), ist diese Methodik insbesondere für die Anwendung in größerem Maßstab geeignet. Des Weiteren wurden Techniken zur Permeabiliserung von Corynebacterium glutamicum untersucht und optimiert. Generell sind permeabilisierte Zellen zur Bestimmung von in vivo Enzymkinetiken besser geeignet als isolierte und gereinigte Enzyme. Zur in situ Bestimmung von Kinetiken in enzymatischen Netzwerken wurde in dieser Arbeit eine Methode entwickelt, bei der die Enzymaktivität in permeabilisierten Zellen bestimmt wird und des Weiteren eine MALDI-TOF-MS-basierte Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten erfolgt. Die Quantifizierung von Metaboliten der Glykolyse und des Pentosephosphat-Wegs mittels MALDI-TOF-MS erfolgte mit Hilfe von [U-13C6] Glukose-6-Phosphat als internem Standard. Die bei der MALDI-Messung auftretenden Signal-Unterdrückungen konnten durch Zugabe des Standards korrigiert werden. Durch Messung der entsprechenden Metabolite sowie durch Bestimmung von intrazellulären Enyzmaktivitäten mit Hilfe geeigneter Substrate und Kofaktoren, konnten die Kinetiken von Glykolyse sowie des Pentose-Phosphatweg erfolgreich charakterisiert werden

Assessment of in vitro cardiotoxicity using metabolomics and 13C metabolic flux analysis

The potential of respiration measurements, metabolomics and 13C metabolic flux analysis (13CMFA) for the determination of drug-induced cardiotoxicity was analysed. Two cardiac in vitro models, namely murine HL-1 cells and human embryonic stem cell derived cardiomyocytes (hESC-CM) were applied for this purpose. Respiration measurement in HL-1 cells upon drug treatment revealed distinct EC50 profiles. The toxicity occurred either fast or with a delay. This effect was dependant on the mechanism of toxicity of the respective drugs. Metabolite profiling of HL-1 cells in response to sub-toxic drug concentrations was carried out by using HPLC. The considered metabolites included glucose, lactate, pyruvate and amino acids. The metabolic profiles were drug class dependant, as shown by multivariate statistics, thereby allowing classification of drugs according to their mechanisms of action. 13C-MFA was carried out to determine the effect of Ca2+ channel blocker verapamil and the cytostatic drug doxorubicin on the central metabolism at concentrations which were clinically relevant and non-toxic. Verapamil-treatment resulted in a highly efficient glucose metabolism in HL-1 cells. In both HL-1 cell and hESC-CM, doxorubicin-treatment resulted in an increased oxidative metabolism, most likely to avoid ATP-depletion. The obtained results potentially have pharmacological relevancy, but also provide novel strategies for preclinical toxicity determination of new drug compounds.In dieser Arbeit wurde das Potential von Respirationsmessungen, Metabolomics-Anwendungen und 13C basierten metabolischen Flussanalysen (13C-MFA) zur Bestimmung von Medikamenteninduzierter Kardiotoxizität untersucht. Es wurden HL-1 Kardiomyozyten sowie aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnene Herzzellen (hESC-CM) als in vitro Modelle verwendet. Die Respirationsmessungen an HL-1 Zellen ergaben je nach Medikament sehr unterschiedliche EC50-Dynamiken. Der toxische Effekt trat entweder sehr schnell oder mit einer zeitlichen Verzögerung ein. Die EC50-Dynamiken waren von den Toxizitätsmechanismen der entsprechenden Medikamente abhängig. Die Erstellung von Metabolit-Profilen in HL-1 Zellen wurde nach Gabe von subtoxischen Medikamentenkonzentrationen mittels HPLC durchgeführt. Es wurden Glukose, Laktat, Pyruvat sowie 20 Aminosäuren gemessen. Mit Hilfe multivariater statistischer Methoden konnten Medikamentenklassen-abhängige Metabolit-Profile bestimmt werden. 13C-MFA wurde angewandt, um den Einfluss des Kalziumkanal-Blockers Verapamil sowie des Zytostatikums Doxorubicin auf den Zentralstoffwechsel zu bestimmen. Die betrachteten Konzentrationen der Wirkstoffe waren sowohl klinisch relevant also auch nicht toxisch. Die Behandlung von HL-1 Zellen mit Verapamil resultierte in einer deutlich höheren Effizienz in der Glukosenutzung. Sowohl in hESC-CM als auch in HL-1 Zellen resultierte die Doxorubicin- Behandlung in einer Zunahme des oxidativen Stoffwechsels, welche wahrscheinlich der Aufrechterhaltung der intrazellulären ATP-Konzentration dient. Die erzielten Ergebnisse haben pharmakologische Relevanz und zeigen des Weiteren auch neue Strategien für präklinische Kardiotoxizitäts-Messungen von neuen Wirkstoffen

In-depth analysis of the purine biosynthetic pathway of Corynebacterium glutamicum : from local pathway analysis to global phenotype profiling

This thesis focused on the purine biosynthetic pathway of C. glutamicum in order to increase the general understanding of this essential pathway. In a first step, a suitable approach for the reliable quantitation of intracellular purine pools was established and validated, thus allowing targeted metabolite profiling of genetically engineered C. glutamicum strains. Based on a metabolic engineering strategy, site-directed mutants were generated and comprised modifications of the purine precursor supply (pgi), deletions of degrading reactions (purA and guaB2) and a point mutation (purFK348Q) targeting at a deregulation of the feedback inhibitory control. The individual modifications were combined in C. glutamicum ΔpurA ΔguaB2 purFK348Q Δpgi. Conducting a systems-level approach, a metabolic shift of the purine intermediate distribution was revealed, promoting a tremendous increase of the intracellular concentration of the degradation product hypoxanthine at the expense of IMP. Furthermore, a global phenotypic adaptation, expressed in transient growth stagnation, was observed. These adverse effects were attributed to a decline in the ATP generating capacity and imbalances of the NADPH metabolism caused by the deletion of the first glycolytic enzyme, glucose 6-phosphate isomerase (pgi). Cultivations applied on complex substrates showed a release of these adverse effects, temporarily delaying the growth stagnation phenomenon.Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Untersuchung des Purinbiosynthesewegs in C. glutamicum, welche auf eine Erweiterung des vorliegenden Kenntnisstandes über diesen essentiellen Stoffwechselweg abzielte. Zunächst wurde ein geeignetes Verfahren zur Quantifizierung intrazellulärer Purinpools etabliert und validiert. Dies bildete die Grundlage zur Erstellung gezielter metabolischer Profile genetisch veränderter C. glutamicum Stämme. Die eingebrachten genetischen Veränderungen umfassten die Modifizierung der Purin-Vorläuferbereitstellung (pgi), die Deletion beteiligter Abbauwege (purA und guaB2), sowie die Einführung einer Punktmutation (purFK348Q). Letztere hatte die Deregulation der Feedback-Inhibierung zum Ziel. Eine system-orientierte Analyse der Mutante C. glutamicum ΔpurA ΔguaB2 purFK348Q Δpgi wies eine ausgeprägte Verschiebung der intrazellulären Purinpools auf, die zu einem drastischen Konzentrationsanstieg des Abbauproduktes Hypoxanthin führte. Desweiteren resultierten die genetischen Veränderungen in einer phänotypisch-globalen Adaption, die sich durch einen vorübergehenden Wachstumsstillstand auszeichnete. Die nachteiligen Effekte - die sich sowohl lokal im Hinblick auf den Purinweg, aber auch global mit Auswirkungen auf den gesamten Phänotyp - zeigten, wurden auf ein verringertes Potential zur Energiegewinnung, sowie auf ein Ungleichgewicht im NADPH-Metabolismus zurückgeführt. Diese Effekte wurden durch den Einsatz komplexer Medienbestandteile teilweise eliminiert

Primary metabolism and its regulation in the human cell line AGE1.HN – application of metabolic flux analysis for improved biopharmaceutical production

This thesis focused on generating a detailed understanding of the primary metabolism and its regulation in the novel human cell line AGE1.HN and the application of the acquired knowledge to improve biopharmaceutical production. The different issues that were addressed include (i) metabolic shifts during cultivation, (ii) metabolite channeling and metabolic fluxes during overflow metabolism, (iii) primary metabolism at various substrate levels and the effect of different substrate feeding on cell culture process and metabolism, (iv) adaptation of the metabolism to ammonia stress, (v) metabolism and metabolic burden imposed by recombinant α1-antitrypsin production, and (vi) improvement of metabolism and biopharmaceutical production in AGE1.HN. Several types of metabolic network modeling and metabolic flux analysis (MFA) were applied. A time resolved MFA approach was developed to analyze metabolic shifts over time. Stationary MFA using mass balances was used extensively to identify alterations in the metabolism induced by physiological perturbations. 13C tracers and 13C MFA were applied to get in-depth insights into metabolite channeling and compartmented fluxes in the metabolism. The presented results provide valuable guidance for improvement of AGE1.HN, in particular, and of the biopharmaceutical production in mammalian cells in general. Additionally, this thesis contributes to an improved understanding of metabolic regulation in human cells.In dieser Arbeit wurden der Primärmetabolismus und dessen Regulation in der humanen Zelllinie AGE1.HN analysiert, wobei der Fokus auf der Anwendung des erworbenen Wissens zur Verbesserung der biopharmazeutischen Produktion lag. Folgende Aspekte wurden untersucht: (i) Veränderungen des Metabolismus im Kultivierungsverlauf, (ii) metabolische Flüsse unter Überflussbedingungen, (iii) Metabolismus und α1-Antitrypsin-Produktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen, (iv) Anpassung des Metabolismus an Ammonium-Stress, (v) zelluläre und metabolische Adaptation an die Produktion von rekombinantem α1-Antitrypsin und (vi) Verbesserung des Metabolismus und der biopharmazeutischen Produktion in AGE1.HN. Verschiedene Arten der Modellierung von metabolischen Netzwerken sowie der metabolischen Flussanalyse (MFA) wurden hierbei angewendet. Eine dynamische MFA Methode wurde zur Analyse metabolischer Veränderungen entwickelt. Stationäre MFA wurde verwendet um Anpassungen des Metabolismus zu charakterisieren. 13C Markierungsexperimente sowie 13C MFA wurden genutzt um detaillierte Einsichten in das Channeling von Metaboliten sowie in die metabolischen Flüsse innerhalb und zwischen verschiedenen Kompartimenten zu erlangen. Die Ergebnisse stellen eine wertvolle Basis zur weiteren Verbesserung der biopharmazeutischen Produktion in AGE1.HN sowie in anderen Säugerzellen dar. Die vorliegende Arbeit trägt zusätzlich zu einem besseren Verständnis der Metabolismus-Regulation in humanen Zellen bei