Development and optimisation of tools for preclinical studies on Parkinson's disease

Successful drug development requires numerous tests to deem a drug safe and efficacious. Before clinical trials, preclinical testing is needed to ensure that the drug can be safely tried out in humans. In preclinical testing, efficacy is also assessed to minimise the risk of a drug failing in clinical trials. Parkinson’s disease (PD) is a common age-associated neurodegenerative disease characterised by distinct debilitating motor symptoms caused by the dysfunction of the dopaminergic nigrostriatal pathway. For PD, a plethora of cellular and animal models have been developed to study the pathophysiology of the disease and to test potential new therapeutic interventions for treating the disease. New models are constantly created. However, methods to study outcomes also need to be developed and refined for reliable and reproducible results, which is pivotal to demonstrating the efficacy of drugs. This dissertation work developed new tools and refined current methods to study PD in preclinical models and studied the characteristics of the cytomegalovirus (CMV) promoter and a primary culture of postnatal dopamine neurons used to model PD. First, we used infrared analysis of optical densities to assess the striatal innervation of tyrosine hydroxylase-positive (TH+) fibres in rat brain sections, a useful alternative to colourimetric optical density analyses. We also developed a novel method based on convolutional neural network algorithms to count dopaminergic neurons from rodent brain sections. The number of neurons counted had a high degree of correlation with results obtained using other counting methods, and counting was substantially faster with the algorithm. Additionally, we developed reporter assays, both reporter plasmids, and cell lines, to measure the activity of a PD-associated drug target, Dicer. These assays, using either exogenous or endogenous fluorescent and bioluminescent indicators, were validated and produced comparable results to previously published similar assays in more physiologically relevant conditions. We also found out that a commonly used promoter in gene therapy, the CMV promoter, could be activated by neurotransmission. We showed in vivo that methamphetamine – a potent dopamine-releasing drug – activated the CMV promoter in the rat brain. Moreover, we observed differences in the distribution of the endoplasmic reticulum between different compartments of cultured mouse TH+ neurons. In summary, the methods and refined tools obtained in these studies expand the toolbox of researchers engaged in studying PD preclinically and may be applicable to other disease areas and human clinical studies as well. Furthermore, our findings on the activation of the CMV promoter are important to consider when designing gene expression systems, reporter assays, or gene therapies for preclinical PD studies utilising amphetamines. And finally, we gained novel insight into the ultrastructural characteristics of cultured postnatal dopamine neurons and provided a valuable resource for the research community.Onnistunut lääkekehitys vaatii useita tutkimuksia, jolla lääkeaine voidaan osoittaa turvalliseksi ja tehokkaaksi. Ennen kliiniisiä kokeita, prekliinissisä kokeissa lääkeaineen turvallisuudesta tulee varmistua voidakseen sitä tutkia potilailla. Prekliinisissä kokeissa myös lääkeaineen tehoa tarkastellaan minimoidakseen riski epäonnistua kliinisissä tutkimuksissa. Parkinsonin tauti on yleinen hermostoa rappeuttava sairaus, joka aiheuttaa haitallisia ja tunnusomaisia liikehäiriöitä, jotka johtuvat keskiaivojen dopamiinijärjestelmän toimintahäiriöstä. Parkinsonin tautiin on kehitetty valtava määrä solu- ja eläinmalleja taudin patofysiologian tutkimiseksi ja uusien lääkkeiden tehon osoittamiseksi. Uusia malleja kehitetään jatkuvasti lisää, mutta myös lopputuloksia määrittäviä menetelmiä tulisi kehittää ja parantaa luotettavien ja toistettavien tulosten aikaansaamiseksi. Tämä on erityisen tärkeää, kun aikeena on osoittaa lääkeaine tehokkaaksi. Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin uusia työkaluja ja paranneltiin aiempia menetelmiä Parkinsonin taudin tutkimiseksi prekliinisissä malleissa, ja tutkittiin cytomegalovirus (CMV) promoottorin sekä Parkinsonin taudin mallintamiseen soveltuvan dopaamiinihermosoluviljelmän ominaisuuksia. Ensiksi hyödynsimme rotan striatumin tyrosiinihydroksylaasi positiivisten (TH+) hermosoluyhteyksien optisten tiheyksien mittaamisessa infrapuna-analyysiä, tavallisen väriaineanalyysin sijaan, tarjoten vaihtoehtoisen menetelmän optisten tiheyksien mittaamiseksi. Lisäksi kehitimme uuden hermoverkkoalgoritmeihin perustuvan menetelmän solujen laskemiseksi jyrsijöiden aivoleikkeistä. Solulaskelmat korreloivat voimakkaasti muilla laskentamenetelmillä saatujen tulosten kanssa ja algoritmilla saadut laskelmat olivat huomattavasti nopeampia. Kehitimme myös, sekä plasmidi- että solupohjaisia, reportterikokeita Parkinsonin tautiin liitetyn entsyymin, Dicerin, aktivaation mittaamiseksi. Nämä reportterikokeet, jotka hyödynsivät ekso- ja endogeenisiä fluoresenssi- sekä luminesenssi-indikaattoreita, validoitiin ja tulokset olivat verrattavissa aiempiin julkaistuihin reporttereihin, paranneltujen fysiologisesti suotuisien olosuhteiden myötä. Näiden lisäksi huomasimme, että CMV promoottori, jota käytetään geeniterapioissa, voi aktivoitua neurotransmission myötä. Osoitimme in vivo, että metamfetamiinin – voimakas dopamiinia vapautta aine – annostelun myötä CMV promoottori aktivoitui rottien aivoissa. Viimeiseksi huomasimme eroja solulimakalvoston rakenteissa viljeltyjen hiiren TH+ hermosolujen eri osissa. Yhteenvetona, tässä työssä kehitetyt ja parannellut työkalut laajentavat Parkinsonin taudin prekliinisten tutkijoiden työkalurepertuaaria, mutta ne ovat myös mahdollisesti sovellettavissa muiden tautien, sekä kliinisten tutkimusten, tutkimiseen. Lisäksi löydöksemme CMV-promoottorin aktivaatiosta, on tärkeä tieto ottaa huomioon suunnitellessa ekspressiovektoreita, reportterikokeita, ja geeniterapioita käytettäväksi prekliiniisissä Parkinsonin taudin kokeissa, joissa käytetään amfetamiineja. Ja lopuksi, saimme uusia havaintoja viljeltyjen dopamiinihermosolujen ultrarakenteellisista ominaisuuksista ja tuotimme hyödyllisen resurssin tutkijoiden käytettäväksi