20,395 research outputs found

    Identifying and responding to people with mild learning disabilities in the probation service

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    It has long been recognised that, like many other individuals, people with learningdisabilities find their way into the criminal justice system. This fact is not disputed. Whathas been disputed, however, is the extent to which those with learning disabilities arerepresented within the various agencies of the criminal justice system and the ways inwhich the criminal justice system (and society) should address this. Recently, social andlegislative confusion over the best way to deal with offenders with learning disabilities andmental health problems has meant that the waters have become even more muddied.Despite current government uncertainty concerning the best way to support offenders withlearning disabilities, the probation service is likely to continue to play a key role in thesupervision of such offenders. The three studies contained herein aim to clarify the extentto which those with learning disabilities are represented in the probation service, toexamine the effectiveness of probation for them and to explore some of the ways in whichprobation could be adapted to fit their needs.Study 1 and study 2 showed that around 10% of offenders on probation in Kent appearedto have an IQ below 75, putting them in the bottom 5% of the general population. Study 3was designed to assess some of the support needs of those with learning disabilities in theprobation service, finding that many of the materials used by the probation service arelikely to be too complex for those with learning disabilities to use effectively. To addressthis, a model for service provision is tentatively suggested. This is based on the findings ofthe three studies and a pragmatic assessment of what the probation service is likely to becapable of achieving in the near future

    Structure and adsorption properties of gas-ionic liquid interfaces

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    Supported ionic liquids are a diverse class of materials that have been considered as a promising approach to design new surface properties within solids for gas adsorption and separation applications. In these materials, the surface morphology and composition of a porous solid are modified by depositing ionic liquid. The resulting materials exhibit a unique combination of structural and gas adsorption properties arising from both components, the support, and the liquid. Naturally, theoretical and experimental studies devoted to understanding the underlying principles of exhibited interfacial properties have been an intense area of research. However, a complete understanding of the interplay between interfacial gas-liquid and liquid-solid interactions as well as molecular details of these processes remains elusive. The proposed problem is challenging and in this thesis, it is approached from two different perspectives applying computational and experimental techniques. In particular, molecular dynamics simulations are used to model gas adsorption in films of ionic liquids on a molecular level. A detailed description of the modeled systems is possible if the interfacial and bulk properties of ionic liquid films are separated. In this study, we use a unique method that recognizes the interfacial and bulk structures of ionic liquids and distinguishes gas adsorption from gas solubility. By combining classical nitrogen sorption experiments with a mean-field theory, we study how liquid-solid interactions influence the adsorption of ionic liquids on the surface of the porous support. The developed approach was applied to a range of ionic liquids that feature different interaction behavior with gas and porous support. Using molecular simulations with interfacial analysis, it was discovered that gas adsorption capacity can be directly related to gas solubility data, allowing the development of a predictive model for the gas adsorption performance of ionic liquid films. Furthermore, it was found that this CO2 adsorption on the surface of ionic liquid films is determined by the specific arrangement of cations and anions on the surface. A particularly important result is that, for the first time, a quantitative relation between these structural and adsorption properties of different ionic liquid films has been established. This link between two types of properties determines design principles for supported ionic liquids. However, the proposed predictive model and design principles rely on the assumption that the ionic liquid is uniformly distributed on the surface of the porous support. To test how ionic liquids behave under confinement, nitrogen physisorption experiments were conducted for micro‐ and mesopore analysis of supported ionic liquid materials. In conjunction with mean-field density functional theory applied to the lattice gas and pore models, we revealed different scenarios for the pore-filling mechanism depending on the strength of the liquid-solid interactions. In this thesis, a combination of computational and experimental studies provides a framework for the characterization of complex interfacial gas-liquid and liquid-solid processes. It is shown that interfacial analysis is a powerful tool for studying molecular-level interactions between different phases. Finally, nitrogen sorption experiments were effectively used to obtain information on the structure of supported ionic liquids

    Balancing the urban stomach: public health, food selling and consumption in London, c. 1558-1640

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    Until recently, public health histories have been predominantly shaped by medical and scientific perspectives, to the neglect of their wider social, economic and political contexts. These medically-minded studies have tended to present broad, sweeping narratives of health policy's explicit successes or failures, often focusing on extraordinary periods of epidemic disease viewed from a national context. This approach is problematic, particularly in studies of public health practice prior to 1800. Before the rise of modern scientific medicine, public health policies were more often influenced by shared social, cultural, economic and religious values which favoured maintaining hierarchy, stability and concern for 'the common good'. These values have frequently been overlooked by modern researchers. This has yielded pessimistic assessments of contemporary sanitation, implying that local authorities did not care about or prioritise the health of populations. Overly medicalised perspectives have further restricted historians' investigation and use of source material, their interpretation of multifaceted and sometimes contested cultural practices such as fasting, and their examination of habitual - and not just extraordinary - health actions. These perspectives have encouraged a focus on reactive - rather than preventative - measures. This thesis contributes to a growing body of research that expands our restrictive understandings of pre-modern public health. It focuses on how public health practices were regulated, monitored and expanded in later Tudor and early Stuart London, with a particular focus on consumption and food-selling. Acknowledging the fundamental public health value of maintaining urban foodways, it investigates how contemporaries sought to manage consumption, food production waste, and vending practices in the early modern City's wards and parishes. It delineates the practical and political distinctions between food and medicine, broadly investigates the activities, reputations of and correlations between London's guild and itinerant food vendors and licensed and irregular medical practitioners, traces the directions in which different kinds of public health policy filtered up or down, and explores how policies were enacted at a national and local level. Finally, it compares and contrasts habitual and extraordinary public health regulations, with a particular focus on how perceptions of and actual food shortages, paired with the omnipresent threat of disease, impacted broader aspects of civic life

    Uso de las histonas circulantes y sus modificaciones post-traduccionales como biomarcadores en sepsis y shock séptico

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    La sepsis es una afección potencialmente mortal causada por una respuesta anormal del huésped a una infección, produciendo respuestas fisiológicas alteradas que dañan los propios tejidos del paciente y pueden provocar disfunción orgánica e incluso la muerte. Asimismo, algunos pacientes sépticos progresan a shock séptico, caracterizado por alteraciones circulatorias, celulares y metabólicas sustanciales que aumentan el riesgo de mortalidad. A pesar de que la sepsis se caracteriza por un mal funcionamiento del sistema inmunológico, lo que a su vez conduce a una respuesta inmune alterada e inmunosupresión, la alta complejidad de la fisiopatología de la sepsis requiere una mayor investigación para comprender las respuestas inmunes que ocurren durante la sepsis. Asimismo, las histonas extracelulares circulantes han ganado relevancia como mediadores citotóxicos en la sepsis, ya que actúan como patrones moleculares asociados a daño, que inducen estrés oxidativo y activan el inflamasoma NLRP3. Estos mecanismos median la activación de la piroptosis, un mecanismo de muerte celular programada que produce inflamación mediante la expresión de IL-18, IL-1β and IL-1α. Sin embargo, a pesar de la evidencia de activación del inflamasoma en las células inmunes durante la sepsis, se desconoce si las histonas extracelulares son capaces de activar los inflamasomas endoteliales y sus consecuencias. En este trabajo destacamos el papel previamente desconocido de las histonas extracelulares, mediando la activación del inflamasoma NLRP3 y la piroptosis en las células endoteliales, contribuyendo a la disfunción endotelial y la desregulación de la respuesta inmune mediada por el endotelio. Asimismo, también demostramos cómo la acetilación de histonas disminuye la activación de la piroptosis. Además, demostramos que la piroptosis se produce en pacientes con shock séptico y los niveles de histonas circulantes se correlacionan con la expresión de citoquinas proinflamatorias y citoquinas piroptóticas, la liberación de factores de adhesión endotelial y la gravedad de la enfermedad. Proponemos la piroptosis mediada por histonas como un nuevo objetivo para desarrollar intervenciones clínicas. De manera similar, hemos analizado las respuestas inmunorelacionadas que ocurren durante las primeras etapas de la sepsis con el objetivo de proporcionar nuevos datos comparando las cantidades de citoquinas, inmunomoduladores y otros mediadores endoteliales en pacientes críticamente enfermos no sépticos, sépticos y de shock séptico. Nuestro enfoque ayudará a caracterizar rápidamente las respuestas inmunes alteradas en pacientes sépticos y de shock séptico ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos. Finalmente analizamos el papel de la metilación del ADN en el control del sistema inmune séptico. Nuestros resultados demostraron el papel central de la metilación del ADN modulando la respuesta molecular en los pacientes de shock séptico y contribuyendo a la inmunosupresión, a través de la alteración de los patrones de metilación de los promotores de IL-10 y TREM-2.Sepsis is a life-threatening condition caused by an abnormal host response to an infection that produce altered physiological responses which damages own tissues of the patient and can result in organ dysfunction and in some cases death. Likewise, a subset of septic patients progresses to septic shock, characterized by substantial circulatory, cellular and metabolic abnormalities, which substantially increase the risk of mortality. Sepsis is characterized by a malfunction of the immune system and it can lead to an altered immune response and immunosuppression. Moreover, the high complexity of the pathophysiology of sepsis requires of further investigation to characterize the immune responses in sepsis and septic shock. Likewise, circulating extracellular histones have gained relevance as cytotoxic mediators in sepsis pathophysiology, since they act as damage-associated molecular patterns, which induce oxidative stress and activate NLRP3 inflammasome. Subsequently, inflammasome mediates pyroptosis activation, a programmed cell death mechanism that produces inflammation through the release of IL-18, IL-1β and IL-1α. However, despite inflammasome activation may occur in immune cells during sepsis, it is unknown if this process also takes place in endothelial cells and particularly whether extracellular histones are capable of activating endothelial inflammasomes and their consequences. In this work we highlight a previously unknown role for extracellular histones, that mediates the activation of NLRP3 inflammasome and pyroptosis in endothelial cells by contributing to endothelial dysfunction and the dysregulation of the immune response mediated by endothelium. Likewise, we demonstrated how histone acetylation decreases pyroptosis activation. Furthermore, we show how pyroptosis occurs in septic shock patients and how circulating histone levels correlate with the expression of pro-inflammatory and pyroptotic cytokines, the release of endothelial adhesion factors and septic shock severity. We propose histone-mediated pyroptosis as a new target to develop clinical interventions. Similarly, we have analyzed the immune-related responses occurring during the early stages of sepsis with the aim of providing new data by comparing the amounts of cytokines, immune modulators and other endothelial mediators in critically-ill non-septic patients, septic and septic shock patients. Our approach will help to rapidly characterize the altered immune responses in septic and septic shock patients admitted in the Intensive Care Unit. Finally, we also analyzed the role of DNA methylation in the control of septic immune system. Our results demonstrated the central role of DNA methylation modulating the molecular response in septic shock patients and contributing to immunosuppression, through the alteration of DNA methylation patterns of IL-10 and TREM2 promoters

    Mixed-mode oscillations in singularly perturbed three-timescale systems

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    In this work, we are concerned with the dynamics of three-dimensional, three-timescale systems of ordinary differential equations. Systems with two timescales have been extensively studied, while the theory of systems with three or more timescales is less developed, although in some cases they provide more realistic modelling of natural systems. Our focus is on mixed-mode oscillations (MMOs), i.e., on trajectories which consist of alternating small-amplitude oscillations (SAOs) and large excursions or large-amplitude oscillations (LAOs). We aim to understand the underlying mechanisms that are responsible for the qualitative properties of these trajectories, as well as to classify the various behaviours of these systems upon variation of their parameters, using geometric singular perturbation theory (GSPT). In the first part, we present a new prototypical system that captures a geometric mechanism which distinguishes between MMOs that feature SAOs only in one region of the phase space from those which feature SAOs in two distinct regions of the phase space; we refer to the former as MMOs with single SAO-epochs and to the latter as MMOs with double SAO-epochs. In essence, this distinction is based on the relative position of points where normal hyperbolicity with respect to the fast flow is lost. In the second part, we show that the Koper model, a well known system from chemical kinetics, is merely a particular realisation of the prototypical example that we introduced in the first part. This system has been extensively studied in the two-timescale context, but, to our knowledge, it has not been studied in the three-timescale context before. We hence classify its dynamics in dependence of its parameters in the three-timescale context, and we show that some phenomena that are delicate in the two-timescale setting, like MMOs with double SAO epochs, become robust in the three-timescale one. In the third part, we show that the four-dimensional Hodgkin-Huxley equations from mathematical neuroscience can be reduced to a three-dimensional, three-timescale system. We then illustrate that, in particular parameter regimes, this system features similar properties to the prototypical example that we introduced in the first part, and we show how the theory that we introduced in the previous chapters can be used to explain its behaviour. From another point of view, we show that the system can be written in the non-standard form of GSPT, and we show that its oscillatory dynamics can be explained by extending the notions that we introduced in the previous chapters. In the fourth part, we study a three-dimensional system that describes the El-Ni˜no Southern Oscillation (ENSO) phenomenon. This system has too been extensively studied in the two-timescale context but not in the three-timescale one. However, this system is more complicated in terms of its invariant manifold structure compared to the other two systems mentioned above. Extending some notions from the previous parts and based again on the relative position of sets where normal hyperbolicity with respect to the fast flow is lost, we distinguish between oscillations with different qualitative properties. Moreover, we perform a desingularisation analysis of the sets where normal hyperbolicity is lost and we give estimates on bifurcation-delay phenomena, which are points that had not been addressed in previous works. In summary, this work is concerned with local and global phenomena in three-timescale systems. The focus is (a) on systems that have previously been analysed only in the two-timescale context, like the Koper and ENSO models, thus exploring the dynamics in the three-timescale setting, and (b) on systems that have been studied in the multi-timescale context (more than two) in the past, but not in the GSPT framework, and where the mechanisms that encode transitions between qualitatively different behaviours were elusive, like the Hodgkin-Huxley equations. The various qualitative behaviours depend on the underlying geometry of these systems, and the extended prototypical example that we propose does not only provide a geometric mechanism that is directly applicable to other systems, like the Koper model and the Hodgkin-Huxley equations, but also, by simple extension of some notions, provides insight on the dynamics and possible behaviours in three-timescale systems with more complicated geometry, like the ENSO model. Finally, we remark on some phenomena that are not robust in the two-timescale setting, but become robust in the three timescale one

    Breaking Ub with Leishmania mexicana: a ubiquitin activating enzyme as a novel therapeutic target for leishmaniasis

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    Leishmaniasis is a neglected tropical disease, which inflicts a variety of gruesome pathologies on humans. The number of individuals afflicted with leishmaniasis is thought to vary between 0.7 and 1.2 million annually, of whom it is estimated that 20 to 40 thousand die. This problem is exemplary of inequality in healthcare – current leishmaniasis treatments are inadequate due to toxicity, cost, and ineffectiveness, so there is an urgent need for improved chemotherapies. Ubiquitination is a biochemical pathway that has received attention in cancer research. It is the process of adding the ubiquitin protein as a post-translational modification to substrate proteins, using an enzymatic cascade comprised of enzymes termed E1s, E2s, and E3s. Ubiquitination can lead to degradation of substrate proteins, or otherwise modulate their function. As the name suggests, this modification can be found across eukaryotic cell biology. As such, interfering with ubiquitination may interfere with essential biological processes, which means ubiquitination may present a new therapeutic target for leishmaniasis. Before ubiquitination inhibitors can be designed, components of the ubiquitination system must be identified. To this end, a bioinformatic screening campaign employed BLASTs and hidden Markov models, using characterised orthologs from model organisms as bait, to screen publicly-available Leishmania mexicana genome sequence databases, searching for genes encoding putative E1s, E2s, and E3s. To confirm some of these identifications on a protein level, activity-based probes, protein pulldowns, and mass spectrometry were used. Using an activity-based probe that emulates the structure of adenylated ubiquitin, E1s were identified, and their relative abundance quantified. A chemical crosslinker extended the reach of this probe, allowing the identification of an E2 (LmxM.33.0900). It is noted that L. mexicana has two E1s – unusual for a single celled organism. Of these E1s, LmxM.34.3060 was considerably more abundant than LmxM.23.0550 in both major life cycle stages of the in vitro Leishmania cultures. It is important to describe the wider context of these enzymes – what is their interactome, what are their substrates? To study this, CRISPR was used to fuse a proximity-based labelling system, BioID, on genes of interest – LmxM.34.3060 and LmxM.33.0900. The E2 (LmxM.33.0900) was shown to interact with the E1 (LmxM.34.3060), validating the results from the activity-based probe and crosslinker experiments. Due to sequence homology with characterised orthologs, the E2 was hypothesised to function in the endoplasmic reticulum degradation pathway. Immunoprecipitations of a ubiquitin motif, diglycine, were conducted with a view to gathering information on the substrates of ubiquitin. Anti-diglycine peptides included some of those identified by BioID. Experiments examining ubiquitin’s role in the DNA damage response were also initiated, as were improvements to the proximity-based labelling system, however these were not followed to completion due to a lack of time and resources. To examine the possibility of finding novel drug targets in the ubiquitination cascade, recombinant proteins were expressed. LmxM.34.3060 was expressed in a functional form, while a putative SUMO E2 (LmxM.02.0390) was functional after refolding. Expressed LmxM.33.0900 was not functional and could not be refolded into a functional form. Drug assays were conducted on LmxM.34.3060, which found an inhibitor of the human ortholog, TAK-243, to be 20-fold less effective against the Leishmania enzyme. Additional assays found an inhibitor that was 50-fold more effective at inhibiting the Leishmania enzyme as opposed to its human equivalent - 5'O-sulfamoyl adenosine. Furthermore, a new mechanism of action, inhibiting the E1, for was identified for drugs previously characterised to inhibit protein synthesis. LmxM.34.3060 underwent biophysical characterisation, with structural information obtained using SAXS and protein crystallography. A crystal structure was solved to 3.1 Å, with the in-solution SAXS structure complementary to this. TAK-243 was modelled into the LmxM.34.3060 structure and clashes were predicted, concurring with TAK-243’s reduced efficacy against the Leishmania enzyme in the drug assays. This project aimed to characterise the potential of an understudied biochemical system to provide novel therapeutic targets for a neglected tropical pathogen. To achieve this aim it presents the identifications of two E1s, an interactome, a structure, and a potent, selective inhibitor of a Leishmania ubiquitin activating enzyme

    The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis

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    Bacillus thuringiensis, también conocida como “Bt”, es una bacteria gram positiva que forma endosporas. Se trata de un organismo ubicuo, aunque se encuentra principalmente en el suelo o en ambientes con alta presencia de insectos. Fue aislada por primera vez en 1901 por el bacteriólogo Shigetane Ishiwata en muestras de intestino de gusanos de seda (Bombyx mori) infectados y fue apodada como “Sottokin- Bacillus” (“Bacilo de muerte súbita”) por la muerte que causaba cuando era ingerida por larvas de gusanos de seda. Pocos años después, el biólogo Ernst Berliner aisló B. thuringiensis de crisálidas de polilla mediterránea de la harina (Ephestia kuehniella) infectadas con esta bacteria en la provincia de Thuringia, Alemania, otorgándole el nombre por el que se conoce en la actualidad. Además, Berliner describió la presencia de una especie de cristal dentro de la célula bacteriana, aunque la naturaleza de este elemento era desconocida en ese momento. Fue en 1954 cuando el microbiólogo Thomas A. Angus descubrió que esas inclusiones proteicas con formas de cristal, producidas en la fase de esporulación de Bt, eran responsables de su acción insecticida y las apodó “proteínas Cry” (del inglés crystal). A parte de estas proteínas, se han descrito varios factores de virulencia posteriormente, tal y como la b-exotoxina, la cual puede inhibir ARN polimerasas dependientes de ADN, las hemolisinas, o exoenzimas como las quitinasas. En el año 1996 se descubrió una nueva clase de proteínas, conocidas actualmente como Vip3 (de las siglas en inglés “Proteínas Vegetativas Insecticidas”), producidas durante la fase vegetativa de Bt, las cuales son altamente tóxicas para lepidópteros. Desde entonces, una amplia variedad de proteínas de Bt tóxicas para diferentes invertebrados (principalmente insectos y nematodos) han sido identificadas a partir de un gran número de cepas aisladas, y han sido clasificadas en función de la similitud de su secuencia proteica. En la actualidad existen 391 secuencias holotípicas de proteínas Bt, y los principales órdenes de insectos que han mostrado susceptibilidad a algún tipo de proteína son Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera. Esta tesis se centra en el estudio de dos familias de proteínas, las proteínas Cry de tres dominios (“3D-Cry”) ylas proteínas Vip3 que afectan a lepidópteros. El modo de acción de estas proteínas, así como el ciclo de vida de Bt tras la infección del insecto constan de una serie de pasos, desarrollados en las siguientes páginas. El primer paso supone la ingestión de Bt por parte del insecto. Tras ello, los cristales que forman las proteínas Cry se solubilizan por la rotura de los puentes disulfuro, liberando las protoxinas presentes en el cristal. Esta solubilización es dependiente tanto del pH como de condiciones reductoras del intestino. En el caso de las proteínas Vip3, no precisan de este paso de solubilización, ya que son secretadas al exterior de la bacteria en forma soluble. Tanto las protoxinas Cry solubilizadas como las protoxinas Vip, son procesadas por enzimas digestivas como las tripsinas y quimotripsinas presentes en los fluidos intestinales, produciendo una toxina activa que en general es resistente a posteriores procesos proteolíticos. Una vez activadas, las toxinas deben atravesar la membrana peritrófica del intestino medio. Esta membrana es una matriz rica en quitina, cuya función principal es la separación entre el alimento y las células epiteliales. Esta separación impide que el alimento pueda tener un efecto abrasivo sobre el intestino y también sirve como primera barrera contra infecciones de tipo bacteriano, vírico o parasítico. Asimismo, el papel protector que ejerce la membrana peritrófica puede verse comprometido por la acción de las quitinasas endógenas o exógenas de Bt (enzimas capaces de degradar la quitina). Tras superar la barrera de la membrana peritrófica, se produce una interacción entre las proteínas Cry o Vip3 y la membrana de borde en cepillo de las células del intestino medio, consideradas como las células diana de las toxinas. Uno de los retos principales en la investigación de Bt durante las últimas décadas ha sido identificar cuáles son las moléculas que se unen de forma específica con las toxinas Cry o Vip3, así como deducir la relevancia de la función de esta interacción, tanto en el modo de acción de las toxinas como en los mecanismos de resistencia. Actualmente, existen tres tipos de proteínas de membrana que pueden funcionar como receptores putativos para las proteínas Cry en insectos: las aminopeptidasas N (“APN”), las cadherinas y los transportadores “ABC” (del inglés “ATP-Binding Cassette”). Aunque inicialmente la fosfatasa alcalina (“ALP”) también fue propuesta como posible receptor, al estar asociada con la resistencia, no se dispone de evidencias claras de su implicación en la unión. En cuanto a los transportadores ABC, son los receptores que mayor importancia han adquirido en los últimos años. Son proteínas de membrana con capacidad para transportar distintas moléculas de forma activa gracias a la hidrólisis de ATP. Dentro de esta gran superfamilia, el transportador más caracterizado ha sido el ABCC2, tanto por su implicación como receptor de proteínas Cry1, como por haber sido encontrado alterado en distintas especies de lepidópteros resistentes a proteínas Bt. En cuanto a las toxinas Vip3, los estudios de interacción han demostrado que los sitios de unión no son compartidos con las toxinas Cry. Existen pocos estudios concluyentes sobre los posibles receptores específicos para las toxinas Vip3. Algunos trabajos indican que tanto la proteína ribosomal S2 como el “scavenger” tipo C pueden actuar como receptores de la toxina Vip3A en varias especies del género Spodoptera. Además, este último se encuentra involucrado en la vía endocítica, siendo capaz de mediar la internalización de la toxina. Existen numerosos estudios que han señalado que la actividad tóxica de las proteínas de Bt se debe principalmente a su habilidad para formar poros en la membrana de las células diana. Este modelo (conocido como modelo de formación de poro) es actualmente el más respaldado por la comunidad científica debido al gran número de trabajos experimentales que lo apoyan tanto para toxinas de tipo Cry como para Vip3. Una vez unidas las toxinas a los receptores específicos, se forma una estructura oligomérica que se inserta en la membrana de las células intestinales constituyendo el poro. De esta forma se pierde la integridad de la membrana, generando un desequilibrio osmótico que provoca un hinchamiento de las células, desembocando en lisis celular. Tras la lisis de las células intestinales se produce una septicemia, causada principalmente por el paso a la hemolinfa no sólo de las propias esporas o formas vegetativas de Bt, sino también de todas aquellas bacterias oportunistas y otros patógenos presentes en el bolo alimentario. Como consecuencia, el insecto acaba muriendo. Por último, Bt puede aprovechar este nicho para continuar creciendo y esporular, favoreciendo su posterior dispersión en el medio. Dada su eficacia como insecticida, el ser humano ha utilizado Bt para contener la expansión de distintas plagas. El primer producto basado en Bt se comercializó en 1938, y desde entonces, su uso, ya sea en formato de formulado Bt o plantas con expresión de genes Bt, ha incrementado notablemente. Como ejemplo, las hectáreas de plantas de maíz, algodón o soja Bt aumentaron de 1,1 millones en el año 1996 a 101 millones en 2017. Por ello, no es de extrañar que B. thuringiensis sea el agente microbiano más utilizado entre las soluciones biotecnológicas presentes en la actualidad. Aunque los investigadores han trabajado durante muchos años en descifrar cómo se comportan las proteínas de este excepcional organismo en el ambiente intestinal de los insectos, aún queda mucho por entender. El conocimiento de forma detallada del modo de acción de las proteínas insecticidas de Bt es un punto clave para garantizar su uso a largo plazo por varias razones; nos permite entender en cierta medida, cuáles son los mecanismos alterados en el desarrollo de la resistencia, dónde se localizan y por qué se encuentran alterados. Además, gracias a este conocimiento podemos combinar proteínas Bt con diferentes modos de acción con la finalidad de maximizar su efecto. En la presente tesis, hemos profundizado en el estudio de estas interacciones mediante distintas aproximaciones. En el primer y segundo capítulo, nos hemos centrado en estudiar las interacciones que ocurren entre las propias proteínas Cry, así como con el transportador ABCC2 de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Dado que esta plaga es de alta relevancia por su impacto en la agricultura, y se encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo, conocer cómo las proteínas Cry1 interaccionan con los receptores del intestino es muy importante, ya que los productos basados en Bt y las plantas Bt que contienen proteínas Cry1 son comúnmente utilizadas para controlar esta plaga. En estos dos capítulos, elegimos una aproximación ex vivo, ya que el uso de estos sistemas, como el cultivo de células de insecto o las preparaciones de vesículas de membrana intestinales (“BBMV”, de sus siglas inglés, Brush Border Membrane Vesicles), nos permiten entender y profundizar en interacciones específicas que pueden pasar desapercibidas durante los ensayos in vivo. Para ello, utilizamos una línea de células de insecto que expresa el transportador ABCC2 en su versión completa, denominada “Sf21- FRA”. Además, utilizamos proteínas Cry1A marcadas con yodo para realizar ensayos de unión y no marcadas para ensayos de viabilidad celular. Descubrimos que las proteínas Cry1A unen de forma específica y con alta afinidad a células que expresan el transportador, y que la presencia de éste en células es suficiente para causar toxicidad de las proteínas Cry1A probadas. Estos resultados apoyan que el ABCC2 de S. exigua actúa como receptor funcional de las proteínas Cry1A, tal y como se ha observado en otras especies plaga. A través de los dos capítulos, la falta de competencia de la proteína Cry1C, así como la ausencia de toxicidad en células HEK que expresan el transportador, descartaron al ABCC2 como receptor para esta proteína. Estos resultados indican que la proteína Cry1C pueda poseer distintos sitios de unión en el intestino medio de S. exigua, ya que es altamente efectiva en el control de esta plaga. Por otra parte, observamos un fenómeno insólito en los ensayos de unión con I125-Cry1Aa, en los que concentraciones bajas de Cry1Aa no marcada y utilizada como competidor, producía una respuesta estimulatoria, causando un incremento de la unión total conseguida por la I125-Cry1Aa a las células expresando el transportador. Dado que a concentraciones altas de competidor, éste competía de una forma habitual, exploramos por qué ocurría este comportamiento bifásico. Pudimos observar también estimulación causada a bajas concentraciones, e incluso más acentuada, al utilizar las proteínas Cry1Ab, Cry1Ac o la proteína híbrida H04 (que contiene los mismos dominios I y II que las proteínas Cry1Ab/c, pero contiene el dominio III de la Cry1C) como competidores contra la I125-Cry1Aa. Sin embargo, no observamos dicho comportamiento bifásico al utilizar la proteína Cry1C o la proteína híbrida H205 (con los mismos dominios I y II que la proteínas Cry1C y mismo dominio III que la Cry1Aa), lo cual indica la importancia de poseer el mismo dominio I, común a estas tres Cry1As, para que se produzca la fase de estimulación de la unión. Curiosamente, también pudimos observar dicho comportamiento, aunque de forma mucho más discreta, cuando utilizamos I125-Cry1Ac y Cry1Aa como competidor. Para revelar la naturaleza del agente causante de la fase estimulatoria, realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la fase insoluble de los ensayos de competencia, así como autoradiografías de la misma. Tanto el tamaño molecular como la intensidad de la banda observada nos permitió determinar que la forma oligomérica de la proteína es la responsable de la respuesta estimulatoria, señalando este hecho la habilidad de las proteínas Cry1A de formar tanto homo- como hetero-oligómeros. Para confirmarlo, utilizamos dos versiones mutantes de Cry1Aa y Cry1Ab, que poseen una sustitución del aminoácido Arg por Glu en la posición 99 del dominio I que impide la oligomerización. La ausencia de fase estimulatoria o banda correspondiente a oligómero en las autoradiografías al usar estos mutantes como competidores, confirman la habilidad de homo- y hetero-oligomerizar de las proteínas en su versión no modificada, a través del dominio I, así como de unir con alta afinidad al transportador ABCC2. Además, las toxicidades observadas con las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac en células expresando el transportador, así como los ensayos de competencia llevados a cabo con I125-Cry1Ac en el primer capítulo, nos permiten concluir que estas dos proteínas comparten un sitio de unión, que tiene poca afinidad por la proteína Cry1Aa. La presencia de este sitio compartido se pudo confirmar con el uso del híbrido H04, lo cual señaló al dominio II de Cry1Ab/c como dominio con mayor afinidad por este sitio. Dado que la proteína Cry1Aa parecía tener un papel menos relevante en la unión a este sitio, pero aún así es tóxica para células expresando el transportador, realizamos experimentos de competencia tanto con I125-Cry1Aa como con I125-Cry1Ac, usando Cry1Aa y el híbrido H205 como competidores. Pudimos concluir que la proteína Cry1Aa debe de tener otro sitio de unión en el transportador, el cual tendría alta afinidad por el dominio III de Cry1Aa. A este sitio de unión, también se podría unir la proteína Cry1Ab con alta afinidad, dado que comparte el mismo dominio III que la Cry1Aa. Por último, a través de distintas combinaciones de proteínas Cry1Aa en ensayos de toxicidad pudimos observar que, la ventaja obtenida al formar mayores concentraciones de hetero-oligómeros que de homo-oligómeros no sólo también se trasladaba a mayores tasas de unión, sino a mayor toxicidad sobre las células. En resumen, el primer capítulo destaca la importancia del ABCC2 como un receptor multivalente para las proteínas Cry1A y el segundo capítulo demuestra la habilidad de formar hetero-oligómeros por las proteínas Cry1Aa para beneficiarse de la multivalencia del transportador. Hasta ahora, es evidente que el transportador ABCC2 de S. exigua y de otros lepidópteros juega un rol relevante en la unión y toxicidad de al menos las proteínas Cry1A, pero pocos miembros de la familia de este transportador han sido caracterizados. Es muy probable que estemos pasando por alto numerosos transportadores ABC que interaccionen con proteínas insecticidas de B. thuringiensis, ya que hasta ahora se han descrito más de 400 transportadores ABC en artrópodos. Por ello, estudiar nuevas interacciones entre transportadores ABC y proteínas insecticidas es un gran reto en la investigación con Bt. A parte del ABCC2, sólo unos pocos transportadores ABC se han relacionado con proteínas Bt, como el ABCB1 del coleóptero Chrysomela tremulae, receptor de la proteína Cry3Aa, el ABCA2 de los lepidópteros Helicoverpa armigera y B. mori, receptor para las proteínas Cry2A, o el ABCC3 de S. exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella, H. armigera y Spodoptera frugiperda, relacionado con la acción de la proteína Cry1Ac. Curiosamente, ningún otro miembro de la familia ABC (aparte del ABCC2) se ha caracterizado en el gusano bellotero Heliothis virescens, plaga en la que se relacionó por primera vez un transportador ABC con las proteínas de Bt, hace ya más de una década. En el tercer capítulo de la tesis, hemos realizado una búsqueda de nuevos transportadores ABC en H. virescens para abordar esta falta de conocimiento. Hemos identificado y descrito dos nuevos transportadores, el ABCC3 y ABCC4. El análisis filogenético ha demostrado alta similitud entre el transportador ABCC3 y el ya descrito ABCC2, como se ha observado en otras especies como H. armigera. Sin embargo, el transportador ABCC4 es una proteína más distante atendiendo a su secuencia de aminoácidos. Según los modelos de predicción, ambos transportadores estarían formados por dos dominios transmembrana y seis regiones en la parte exterior que se corresponden con asas extracelulares. Evaluamos la funcionalidad de los nuevos transportadores como posibles receptores para proteínas Bt desarrollando mutantes de deleción para cada uno de los genes HvABCC3 o HvABCC4 mediante la técnica de CRISPR/Cas9. Para ello, microinyectamos huevos y cruzamos los adultos resultantes hasta obtener líneas de homozigotos mutantes. Seguidamente, realizamos bioensayos con Cry1Aa, Cry1Ac y Vip3A. Los resultados preliminares no mostraron reducción en la toxicidad para ninguna línea mutante, en comparación con la colonia de H. virescens usada como control. Sin embargo, sí se observaron mortalidades ligeramente disminuidas en la concentración más baja de Cry1Ac utilizada, especialmente en la línea de mutantes con deleción en el ABCC3, aunque el grado de significación debe de estudiarse en mayor profundidad dado el bajo número de réplicas en los bioensayos. Además, falta por confirmar la correcta deleción de los transportadores en ambas líneas de mutantes mediante la secuenciación del ARN mensajero de los genes. Dado que los ARN guías utilizados se diseñaron en el primer exón de cada gen, podrían haber pautas de lectura alternativas, por lo que debemos de asegurar que no se estén expresando otras versiones funcionales de los transportadores. Por tanto, la posible implicación de los nuevos transportadores ABC con proteínas Bt tendrá que estudiarse en mayor profundidad. Por ahora, se sabe que el ABCC3 de S. exigua, H. armigera S. exigua, H. armigera y S. frugiperda comparte redundancia funcional con el ABCC2 en el modo de acción de las proteínas Cry1A y juega un rol menor y secundario en su toxicidad. Para comprender si este fuera el caso en H. virescens, son necesarios experimentos adicionales como desarrollar líneas de mutantes con deleción del ABCC2 o dobles mutantes con deleción del ABCC2 y ABCC3, así como la evaluación, mediante ensayos con proteínas marcadas, de las capacidades de unión sobre las líneas de los mutantes. Por último, aparte del ABCC2, ABCC3 y ABCC4, aún queda un gran número de transportadores ABC por describir en H. virescens. Además de estudiar la interacción entre receptores putativos y proteínas Bt y buscar receptores desconocidos, debemos de tratar de entender cómo y por qué ciertas especies plaga consiguen desarrollar resistencia a proteínas Bt, ya que la resistencia es la principal amenaza para el uso continuado de plantas Bt o bioinsecticidas basados en Bt. Está ampliamente aceptado que la alteración de unión al receptor de membrana es la principal causa de resistencia a proteínas Bt en especies plaga, aunque otros mecanismos pueden estar involucrados. Las alteraciones de unión pueden ocurrir por diferentes razones, tales como la reducción en la expresión de un gen que codifique para una proteína de membrana, deleciones en su secuencia, o mutaciones aminoacídicas que impidan la interacción entre la toxina y el receptor. Por ello, es interesante caracterizar la funcionalidad de los receptores que han sido encontrados alterados en diferentes plagas resistentes. A día de hoy, existen numerosos estudios funcionales con las versiones “wild-type” de transportadores ABC usando diferentes técnicas, tales como silenciamiento con ARN de interferencia, deleción mediante CRISPR, o expresión en un sistema ex vivo, pero pocos estudios han caracterizado la funcionalidad de las versiones alteradas de los transportadores ABC de cepas resistentes. Además, se propuso que el mecanismo de transporte activo de los transportadores tiene que funcionar correctamente para que pueda actuar como receptor de las proteínas Cry. En el cuarto capítulo, caracterizamos la funcionalidad de una versión alterada del ABCC2 de una colonia de S. exigua resistente a XentariTM, un bioinsecticida basado en Bt. Este transportador contiene una deleción en el segundo dominio de unión a nucleótidos (“NBD2”) que fue genéticamente ligada a la resistencia en un estudio previo. Sin embargo, no se han realizado ensayos de funcionalidad del transportador mutado para dilucidar si esta mutación es la causa de la resistencia. Para ello, utilizamos una línea celular de insecto que expresa la versión truncada del transportador denominada Sf21-XenR, así como la línea celular utilizada en los dos primeros capítulos que expresa la versión original del ABCC2 (Sf21-FRA). A través del estudio de la secuencia de aminoácidos, identificamos cuatro mutaciones adicionales, en forma de sustitución,tres de las cuales se encontraban en los NBD intracelulares y una de ellas en una de las asas extracelulares (asa extracelular número 4). Las primeras caracterizaciones mediante Western blot e inmunohistoquímica mostraron la expresión del transportador truncado y su localización en la membrana de las células Sf21-XenR, lo cual indica que las mutaciones presentes en el transportador no impiden su presencia en la membrana. Tras ello, realizamos ensayos de viabilidad celular con las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac, tanto en células Sf21-XenR como en células Sf21 no transformadas como control. Las tres proteínas ensayadas fueron tóxicas contra células con expresión del transportador truncado, y a un nivel muy similar al encontrado previamente en células que expresan el transportador en su versión original (Capítulo 1). Además, los ensayos de unión con Cry1Ac marcada con I125 revelaron unión específica al transportador truncado, así como un valor similar en la constante de

    Patterns of subspecies diversity in the giraffe, Giraffa camelopardalis (L. 1758): comparison of systematic methods and their implications for conservation policy

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    This thesis examines the subspecific taxonomic status of the giraffe and considers the role of formal taxonomy in the formulation of conservation policy. Where species show consistent. geographically structured phenotypic variation such geographic patterns may indicate selective forces (or other population-level effects) acting. upon local populations. These consistent geographic patterns may be recognised formally as subspecies and may be of interest in single or multi-species biodiversity or biogeography studies for delimiting areas of conservation priority. Subspecies may also be used in the formulation of management policies and legislation. Subspecies are, by definition, allopatric. This thesis explicitly uses methodology of systematic biology and phylogenetic reconstruction to investigate patterns of variation between geographic groups. The taxonomic status of the giraffe is apposite for review. The species provides three independent data sets that may be analysed quantitatively for geographic structure; pelage patterns, morphology and genetics. Museum specimens. grouped according to geographic origin, were favoured for study as more than one type of data was often available for an individual. Population aggregation analysis of forty pelage pattern characters maintained six separate subspecies, while agglomerating some neighbouring populations into a subspecies. A 'traditional' morphometric approach, using multivariate statistical analysis of adult skull measurements, was complemented by a geometric morphometric approach; landmarkrestricted eigenshape analysis. Four morphologically distinct groups were recognised by both morphological analyses. Phylogenetic analysis of mitochondrial DNA control region sequences indicates five major cIades. Nested cIade analysis identifies population fragmentation, range expansion and genetic isolation by distance as contributing to the genetic structure of the giraffe. The results of the analyses show remarkable congruence. These results are discussed in terms of the formulation of conservation policy and the differing requirements of'blological and legal classification systems. The value of a formal taxonomic framework to the recognition, and subsequent conservation, of biodiversity is emphasised
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