Klonierung und funktionelle Charakterisierung der NTPDase3 aus der Ratte

Extrazelluläre Nukleotide fungieren als auto- und parakrine Signalstoffe aus. Im peripheren und zentralen Nervensystem dienen Nukleotide als Neurotransmitter und Neuro­modulatoren. Die nahezu ubiquitäre Expression von Purin-Rezeptoren läßt auf umfassende physiologische Funktionen schließen. Nukleotide konnen über ionotrope P2X-Rezeptoren oder metabotrobe P2Y-Rezeptoren ihre Signalwirkung vermitteln. Via P1-Rezeptoren kann Adenosin, ein Baustein bzw. Abbauprodukt von ATP, seine neuro­modulatorische und neuro­protektive Wirkung entfalten. Alkalische Phosphatasen, die Ekto-Nukleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Familie (NPP-Familie) und die Ekto-Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase-Familie (E-NTPDasen) können Nukleosiddiphosphate und Nukleosidtriphosphate hydrolysieren. Die E-NTPDasen sind die wahrscheinlichsten Kandidaten für die Moduluation purinerger Signale im Nervensystem. In dieser Arbeit wurde die Klonierung und Charakterisierung der NTPDase3 der Ratte beschrieben. Ein vollständiger cDNA-Klon der NTPDase3 wurde aus einer Rattenhirnbank isoliert, sequenziert und anhand der familientypischen Sequenzmuster (ACRŽs) als E-NTPDase identifiziert. Die Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen der für ein 529 Aminosäuren großes Protein kodierte. Sequenzvergleiche zeigten eine große Ähnlichkeit des Proteins mit den NTPDasen 1, 2 und 8, welche plasma­membran­ständige Ekto-Enzyme sind. Eine plasma­membran­ständige Lokalisation konnte in NTPDase3-transfizierten CHO-Zellen und in PC12-Zellen mit endogener NTPDase3-Expression nachgewiesen werden. Anhand von Computeranalysen und Sequenz­vergleichen wurden Überlegungen zur Sekundär- und Tertiär­struktur angestellt und Ähnlichkeiten zur Zuckerkinase/ Hitzeschock-Protein 70/Aktin-Superfamilie aufgezeigt. Das Protein war entsprechend der in silico-Analyse glykosiliert und ließ sich über das Lektin ConcavalinA anreichern. Messungen an Membran­fraktionen heterelog transfizierter CHO-Zellen zeigten die Hydrolyse verschiedener Nukleosidtriphosphate und Nukleosid­diphosphate mit einer Präferenz für Nukleosid­triphosphate. Das Enzym ist primär Kalziumabhängig und a rbeitet optimal im physiologischen pH-Bereich von pH 7,5 bis pH 8,0. Mit einem ATPase:ADPase-Verhältnis von 5:1 liegt die NTPDase3 zwischen der NTPDase1 und der NTPDase2. Seine biochemischen Eigenschaften machen das Ekto-Enzym zu einem Kandidaten für die Modulation purinerger Signale. Nukleotid-vermittelte Signale können via Hydrolyse durch die NTPDase3, möglicherweise in Kombination mit anderen E-NTPDasen, beendet werden. Als Bestandteil einer Enzymkette mit der Ekto-5Ž-Nukleotidase kann das Enzym zur Produktion des neuro­modulatorisch und neuro­protektiv wirkenden Adenosins beitragen. Mögliche Rollen bei der Regulation autokriner, parakriner und synaptischer Signale in nicht­neuronalen wie neuronalen Geweben wurden für die Gewebe diskutiert, in denen die NTPDase3 per Westernblot nachgewiesen werden konnte. Neben Dünndarm, Prostata, Pancreas, Nebenhoden und Samenleiter wurde ein NTPDase3-Band vor allem im zentralen Nervensystem gefunden. In allen geprüften Hirnteilen (Bulbus olfactorius, Cerebellum, Cortex, Mesencephalon, Diencephalon, Hippocampus, Striatum, Medulla oblongata), dem Rückenmark und der Hypophyse wurde die NTPDase3 im Westernblot detektiert. Das Enzym könnte an der Regulation exokriner Drüsenfunktionen im Pancreas und am epithelialem Ionen­transport involviert sein oder auch bei endokrinen Funktionen des Pankreas und der Hypophyse mitwirken. Möglicherweise hat die NTPDase3 funktionelle Bedeutung bei der Termination und Modulation purinerger Neuro­transmission im enterischen Nervensystem, im Rückenmark und in verschiedenen Hirn­regionen. An verschiedenen zentral­nervösen Funktionen, wie Schmerz­wahrnehmung, Atmungs- und Kreislauf-Regulation sowie Gedächtnis- und Lernprozessen sind purinerge Signale maßgeblich beteiligt und es ist wahrscheinlich, daß E-NTPDasen an der Modulation dieser Signale mitwirken. Die in dieser Arbeit beschriebene NTPDase3 ist ein viel versprechender Kandidat für die Regulation purinerger Signale im peripheren und zentralen Nervensystem

Geweberegeneration und Biokompatibilität nach Implantation von Hydroxylapatit-Polyethylen (HAPEX™) in Weichgewebe und Ulnadefekt beim Kaninchen

Die vorliegende Arbeit überprüft die lokale Verträglichkeit von Polyethylen (PE) und Polyethylen mit 40 vol % Hydroxylapatit (HAPE / HAPEX™) nach Implantation in die Oberarmmuskulatur und in einen Ulnadefekt beim Kaninchen. Die Untersuchungen sollen Aufschluss geben über die Adhäsion von Bindegewebe im Interface und die Beschaffenheit des Interface zwischen Knochengewebe und dem Kompositwerkstoff. Die Ergebnisse dienen der Entwicklung einer modularen Schulterprothese, um die schwierige, aber zur vollständigen Wiederherstellung der Funktion notwendige Weichteilabdeckung zu verbessern. Dazu wurde bei 24 adulten Kaninchen der Rasse „Neuseeländer Riesen“ die linke Ulna im proximalen Drittel teilosteotomiert und ein 7 mm langes Ulnateilstück entfernt. Bei jeweils zwölf Tieren wurde ein 7 x 6 x 8 mm großer Zylinder aus PE bzw. aus HAPE ohne zusätzliche Fixation in diesen Defekt eingelegt. Alle Zylinder hatten eine zentrale Ausbohrung von 200 µm Durchmesser. Jeweils die Hälfte der Zylinder beider Materialgruppen war mit 60 µm großen Kanälchen perforiert, die alle in der zentralen Ausbohrung endeten. In der Schultermuskulatur der selben Gliedmaße wurde eine Implantatscheibe von 3 mm Höhe und 6 mm Durchmesser aus dem gleichen Material implantiert. Als Vorbereitung für die fluoreszenzmikroskopische Auswertung der knöchernen Gewebereaktion wurden den Kaninchen am zehnten und 15., 25. und 30. sowie am 130. und 135. postoperativen Tag subkutan die Fluorochrome Calcein, Alizarin complexone und Tetrazyklin injiziert. Direkt post operationem sowie nach 3, 5, 10 und 20 Wochen fanden Röntgenkontrollen statt. Nach 5 bzw. 20 Wochen Beobachtungszeit wurden jeweils 12 Tiere getötet. Die Tierkörper wurden mit Karnovsky-Lösung perfundiert. Radius und Ulna mit anhaftendem Weichgewebe sowie die Muskelblöcke mit den implantierten Probenscheiben wurden entnommen und der histologischen respektive fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung zugeführt. Die zeitliche Zuordnung der Fluorochrome im neu gebildeten Knochengewebe und dessen Struktur veranschaulichten, dass die Geflechtknochenbildung im Defekt bereits um den 10. postoperativen Tag einsetzte. Das volle Ausmaß der Regeneration entwickelte sich zwischen 25. und 30. Tag. Das Remodeling von Geflecht- zu Lamellenknochen war 130 Tage nach der Osteotomie so weit vorangeschritten, dass die Konsolidierung der Defekte in fast allen Fällen annähernd erreicht war. Histologisch überwog in der Nähe des Lagerknochens nach fünf Wochen bereits Lamellenknochen, während in Implantatnähe noch Geflechtknochen mit Osteoblastensäumen und Osteoklasten vorherrschte. Bei den HAPE-Implantaten wurde deutlich früher Knochen in Implantatnähe gebildet als bei den Polyethylen-Implantaten. Im Interface zu den PE-Implantaten trat besonders häufig eine bindegewebige Schicht auf. 20 Wochen nach der Implantation beherrschte ein kompaktes Knochengewebe den Bereich der Osteotomie. Dabei handelte es sich überwiegend um Lamellenknochen in Haversschen Systemen. Der Anteil an Geflechtknochen war nur noch gering. Das Remodeling war fast abgeschlossen, und Fettmark hatte sich wieder ausgebildet. Der hohe Anteil an Knorpelzellen in nahezu allen Proben sprach für fehlende Primärstabilität. Die intramuskulären Implantate heilten nahezu reizlos ein. Sie waren von mehreren Schichten straffen Bindegewebes umgeben, das nach 20 Wochen eine Kapsel gebildet hatte. Anzeichen einer Mineralisation des benachbarten Gewebes waren nicht zu bemerken. Hingegen konnte nach 20 Wochen vereinzelt eine geringgradige Degradation der HAPE-Implantate beobachtet werden. An beiden Materialien war der enge Kontakt zu Fasern und Zellen zu erkennen. Allerdings erschien die Verbindung mit HAPEX™ stabiler. In den meisten Fällen hatte eine vollständige Konsolidierung der Ulnadefekte stattgefunden. Die Bildung neuen Knochengewebes war nach fünf Wochen bei den HAPE-Implantaten etwas weiter fortgeschritten als bei den PE-Implantaten. Nach 20 Wochen war das Bild einheitlicher. Zu beiden Nachbeobachtungszeitpunkten gab es zwischen HAPEX™ und Knochen deutlich mehr direkten Kontakt als zwischen Polyethylen und Knochen. Eine Zunahme dieser Areale war jedoch nicht zu bemerken. Eine vollständige knöcherne Integration konnte nur bei drei von zwölf HAPE-Proben nachgewiesen werden. Die Adhäsion von Bindegewebe erschien bei den HAPE-Präparaten dauerhafter. Die Perforationen brachten keine weitere Optimierung. Die Ergebnisse unserer Studie bestätigen die guten Materialeigenschaften von HAPEX™, das sowohl mit Knochengewebe als auch Weichgewebe kompatibel ist. Ein osteoinduktives Verhalten des Materials ist nicht nachzuweisen. Die hervorragenden mechanischen und tribologischen Eigenschaften des Komposits, die durch veränderliche Anteile von Hydroxylapatit bedarfsweise variiert werden können, machen einen Einsatz im lastfreien oder wenig lasttragenden Knochenlager denkbar. Die variablen Gestaltungsmöglichkeiten sowohl der Einzelkomponenten Polyethylen und Hydroxylapatit als auch das veränderliche Gesamtdesign des Komposits bieten das besondere Potential für die Endoprothetik, auch bei lasttragenden Anwendungen. Diese werkstoffseitigen Modifikationen sowie Untersuchungen mit stabilem Defektmodell erscheinen dringend notwendig bevor HAPEX™ die Eignung zur Verwendung bei der eingangs erwähnten Schulterprothese zugesprochen werden kann.Local tissue tolerance of the bone graft substitutes polyethylene (PE) and polyethylene reinforced with 40 vol % hydroxyapatite (HAPE / HAPEX™) was examined in the muscular system of the upper arm and in an ulna defect of 24 white New Zealand rabbits. The aim of this study was to investigate the possibility of soft tissue adherence to the composites as well as the interface between these composites and the bone tissue. The results support the development of a modular shoulder prosthesis in order to improve the overall soft tissue adherence. This is a difficult but necessary task to recover its function entirely. In the caudal aspect of the upper third of the ulna bone fragment of 7 mm length was removed and subsequently substituted for a cylindrical implant. 12 of the animals received PE-implants while the second half received HAPE, both in dense and perforated form. The cylinders were all 7 x 6 x 8 mm and had a central tube of 200 µm. The perforations were 60 µm in diameter and ended all in this central tube. There was no additional stabilisation of the cylinders in the bony defect. Discs with a diameter of 6 mm and a height of 3 mm were implanted into the muscles of the upper arm of the same extremity. On day 10, 15, 25, 30, 130 and 135 after implantation the animals were labelled with the fluorochromes Calcein, Alizarin complexone and Tetracycline. X-ray controls were taken immediately after implantation as well as 3, 5, 10 and 20 weeks after surgery. 6 animals of each group were euthanised on week 5 and 20 respectively. Following body perfusion with Karnowsky solution the treated part of the extremity and the soft tissue implants were investigated using light microscopy together with immunofluorescence techniques. The chronological classification of the fluorochromes in the structure of new grown bone tissue showed that the formation of woven bone already started around day 10. The maximum of new bone production was reached between days 25 to 30 after surgery. In most cases the maturation of woven bone to lamellar bone was finished by day 130. After 5 weeks the histological data already showed lamellar bone next to the ulna, while immature bone predominantly surrounded the implant. The bone production started remarkably earlier in specimens treated with HAPE compared to PE implants. At the interface to the plain polyethylene implants a district layer of connective tissue could be detected. 20 weeks after implantation mainly lamellar bone, a small amount of woven bone and bone marrow were found pointing to the end of the remodeling process. A great amount of chondrozytes in almost every case revealed the lack of stability in the defects. In the muscle tissue the implants were encapsulated by a thin layer of connective tissue showing no signs of inflammation in this fibrous capsule or in the muscle tissue. The soft tissue gave no evidence of mineralisation and just little signs of degradation of HAPE implants after 20 weeks. Soft tissue adherence to both materials could be found while the connection with HAPE was stronger. In most cases bone healing was complete. The production of bony tissue was performed faster in the HAPE samples after 5 weeks but at the end of the study the results of both materials were similar. There was a higher but not significant increase in direct bone contact zones at the interface between HAPE and bone compared to the interface between plain PE and bone. Later points in time did not show any difference in these areas. A complete osseointegration could just be detected in 3 of 12 HAPE samples. Soft tissue adherence seemed to be more durable with HAPEX™. The perforations did not lead to further improvement regarding soft tissue adherence in both materials. These results confirm the good properties of HAPEX™ and its compatibility with both, bony and soft tissue. The capacitiy of osteoinduction just could not be proved. Because of the variable part of HA in the composit its excellent mechanical features can be adapted to different needs in surgery and traumatology. Compared to polyethylene the composite is definitely more suitable for long-term application. The variability of design of the components polyethylene and hydroxylapatite as well as the design of the ready for use composit HAPEX™ offer great potential in implantology even in weight-bearing applications. Before certifying the suitability of HAPEX™ for a new modular shoulder prosthesis there must be some more studies with modifications in material and especially with stability in the defect

Untersuchung humaner Körperflüssigkeiten und Ausscheidungsprodukte auf metall- und metalloidorganische Verbindungen mittels HG/LT-GC/ICP-MS

Die hier vorgestellte HG/LT-GC/ICP-MS (hydride generation/low temperature-gas chromatography /inductively coupled plasma-mass spectrometry)-Kopplung ermöglicht eine simultane Speziierung der Elemente Antimon, Arsen, Bismut, Blei, Germanium, Iod, Quecksilber, Selen, Tellur und Zinn. Die Kombination des eigenkonstruierten gaschromatographischen Separationssystems mit einem ICP-MS-Detektor stellt ein exzellentes Verfahren zur Identifizierung von 44 Spezies mit Nachweisgrenzen im pg-Bereich dar. Die Untersuchung klinischer Proben ist ein wichtiges Gebiet in der Elementspeziierung, die die Gesamtgehaltsbestimmung immer weiter in den Hintergrund drängt. Der Bedarf an Informationen über die Mobilität, Speicherung und Toxizität von metall(oid)organischen Verbindungen in biologischen Systemen wie dem menschlichen Organismus ist essentiell und erfordert Daten nicht nur über die Konzentration der vorhandenen Metall(oid)e, sondern auch über deren Bindungsformen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang die Anwendung der Multielement-Multispezies-Nachweismethode auf klinische Matrices. Hierbei konnten metall- und metalloidorganische Verbindungen sowohl in den Körperflüssigkeiten Speichel und Blut, als auch in den menschlichen Ausscheidungsprodukten Atem, Haar, Stuhl und Urin nachgewiesen werden. Da die Bindungsformen, in der die metall- und metalloidorganischen Verbindungen in allen klinischen Proben mit Ausnahme der Atemproben vorliegen, der Gasanalytik so nicht zugänglich sind, wurden die Analyten mittels der Hydrierungstechnik in ihre korrespondierenden flüchtigen Derivate überführt, welche dann der Separationseinheit zugeführt wurden. Studien mit Kontrolle des Ausscheidungsproduktes Urin zeigten die Auswirkung von Fischverzehr auf Arsen- und Quecksilberkonzentrationen in den Urinproben oder die forcierte Ausscheidung von Arsen-, Selen-, Quecksilber- und Zinnverbindungen nach Einnahme des metall- und metalloidbindenden Präparates Asparagus P. Studien mit Kontrolle des Ausscheidungsproduktes Stuhl zeigten die forcierte Ausscheidung von Germanium-, Arsen-, Quecksilber- und Zinnverbindungen nach Einnahme der metall- und metalloidbindenden Alge Chlorella pyrenoidosa. Ein Vergleich der Atemproben von Probanden mit und ohne Amalgamfüllungen lieferte den Nachweis von elementarem Quecksilber in der Expiration der Amalgamträger, wohingegen im Atem der amalgamfreien Probanden kein Quecksilber nachgewiesen wurde. In Speichelproben, die unmittelbar nach der Entfernung der Amalgamfüllungen genommen wurden gelang der Nachweis von Methyl-, Dimethyl- und Ethylmethylquecksilber. Ebenso konnten in Stuhlproben ein und zwei Tage nach der Entfernung von vier Amalgamfüllungen Methyl- und Dimethylquecksilber nachgewiesen werden. Nach dem Verzehr einer mit anorganischen Bismutsalzen angereicherten Mahlzeit konnte in Atemproben Mono- und Trimethylbismut sowie in Urinproben Mono- und Dimethylbismut nachgewiesen werden. Die hier durchgeführte Speziierung bei Haarproben lieferte ein breites Spektrum an metall- und metalloidorganischen Verbindungen. Für die Spezies der Elemente Arsen, Bismut, Selen, Quecksilber und Zinn konnten die unterschiedlichen Eliminierungspfade aus dem menschlichen Organismus anhand der parallelen Kontrolle der Ausscheidungsprodukte Urin und Stuhl bestimmt werden. Die Methylierung von Selen und Arsen im Organismus konnte nachgewiesen werden, wobei hier auch der Nachweis des Trimethylarsens in Humanurinen gelang. Ferner wurden für die Elemente Antimon und Bismut erste in vivo Hinweise für deren Methylierung im Organismus gefunden. Die Studien über das Element Quecksilber lassen sogar auf die Methylierung anorganischen Quecksilbers sowohl in der Mund- als auch in der Darmflora schließen

Entwicklung und Aufbau einer modularen Konfokal-Multiphotonen-Laserscanning-Messapparatur (CMLTT) für Second Harmonic Generation-, Total Internal Reflectance- und Laser Tweezers-Anwendungen an myofibrillären Präparaten

In der vorliegenden Arbeit wurde eine hochauflösende optische Messapparatur (CMLTT) entwickelt und aufgebaut, die auf einem konfokalen Multiphotonen-Laserscanning-Mikroskop basiert und eine optische Pinzette, ein Modul für innere Totalreflektionsmikroskopie (TIRFM), eine zusätzliche stationäre Multiphotoneneinkopplung sowie Positionsdetektoren enthält. Dabei wurde diese CMLTT-Gesamtapparatur so konzipiert, dass die einzelnen Module weitgehend parallel einsetzbar sind. Der Laserstrahl des Laser tweezers- (optische Pinzette-) Moduls ist mit Hilfe von akustooptischen und elektrooptischen Modulatoren sowohl räumlich wie zeitlich modulierbar. Das TIRFM-Modul ist für zwei Anregungslichtquellen ausgelegt, die Leistung der stationären Multiphotoneinkopplung kann variiert werden. Für die Laser tweezers-Anwendungen stehen insgesamt drei Vierquadranten-Positionsdetektoren zur Verfügung, so dass eine Positionsmessung eingefangener Objekte in allen Mikroskopiemodi möglich ist. Diese modulare CMLTT-Messapparatur wurde an Myofibrillenpräparaten und Einzelmolekülsassays getestet. Sie erlaubte erstmals, hochauflösende Second Harmonic Generation Messungen der 3D-Sarkomerstruktur von Muskelzellen durchzuführen. Darüber hinaus gelang es, die Multiphotonenfreisetzung des Kalziumkäfigmoleküls DMNPE-4 zu realisieren. Auf Einzelmolekülebene wurde die CMLTT-Apparatur benutzt, um die kalziumaktivierte Motilität der molekularen Motoren Aktin und Myosin zu quantifizieren

Chronologie der Naturwissenschaften: Der Weg der Mathematik und der Naturwissenschaften von den Anfängen in das 21. Jahrhundert

Das Werk ist eine Chronologie der mathematisch-naturwissenschaftlichen Entdeckungen und deren Protagonisten. Es enthält ca. zwölftausend Einträge über Entdeckungen und Erfindungen mit den Namen jener Personen, die in den einzelnen Disziplinen (Mathematik, Physik, Chemie, Astro-, Geo- und Biowissenschaften) Entdeckungen gemacht haben. Das Nachschlagewerk ist nach Jahren geordnet und umfasst den Zeitraum zwischen 10.000 v.Chr. bis 1990. Das Werk ergibt damit ein Bild von dem langen und komplizierten Prozess, der von den ersten Erfahrungen und Erkenntnissen über die Natur zu einzelnen wissenschaftlichen Kenntnissen über deren Teilgebiete, dann zu systematischem Wissen über diese Teilgebiete und schließlich zu den heutigen Naturwissenschaften führte. Für die Vor- und Frühgeschichte sind dabei auch Leistungen berücksichtigt, denen das Attribut der Wissenschaftlichkeit zwar nur bedingt zuerkannt werden kann, deren Aufnahme jedoch unabdingbar ist, um die historischen Entwicklungslinien im vollen Umfang nachzuzeichnen. Die Geowissenschaften sind in ihrer ganzen, auch die Länder- bzw. Völkerkunde umfassenden Breite vertreten, wobei auch die Anfänge jener Entwicklungen berücksichtigt wurden, die später zu den heute oft als Humangeographie bezeichneten sozial- und geisteswissenschaftlichen Komponenten der Geowissenschaften (Sozial-, Verkehrs-, Wirtschaftsgeographie usw.) führten. Zudem enthält das Werk Daten zu frühen Universitätsgründungen, zur Formierung verschiedener philosophischer Ideen und Systeme, zur Entstehung bedeutender Akademien, zur Gründung von Vereinigungen der einzelnen Disziplinen, zur Herausgabe von Zeitschriften und zur Konstruktion von wissenschaftlichen Geräten, die – wie Mikroskop, Fernrohr oder Teilchenbeschleuniger – die weitere Forschung maßgeblich beeinflussten. Eine besondere Rolle spielte die Umsetzung naturwissenschaftlicher Ideen in technologischen Verfahren und die sich dabei ergebenden Rückwirkungen auf den Erkenntnisfortschritt in der jeweiligen Disziplin. Die Fülle der Einträge ermöglicht es, eine Vorstellung von den bestimmenden Entwicklungslinien der einzelnen naturwissenschaftlichen Gebiete und der Mathematik in einem beliebigen Zeitraum zu gewinnen und zu erkennen, welchen Platz sie und ihre Disziplinen in der Entwicklung der menschlichen Gesellschaft eingenommen haben bzw. wie sich diese Rolle im Laufe der Jahrhunderte veränderte. Zugleich werden auch die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Disziplinen deutlich.:Geleitwort Vorwort und Danksagung Benutzerhinweise Autoren und deren Beiträge Epochen Vorgeschichte und frühe Hochkulturen Griechisch-hellenistische Antike Mittelalter Renaissance, Humanismus, Reformation Wissenschaftliche Revolution und Rationalismus Die Zeit des Durchbruchs zur Industriewirtschaft Der Industriekapitalismus am Ende des 19. und im Übergang ins 20. Jahrhundert Die Herausbildung der modernen Naturwissenschaften Die Zeit des kalten Krieges Verzeichnisse Verzeichnis der Nobelpreisträger Literaturverzeichnis Personenverzeichnis Sachwortverzeichni