Προκαταρτικές μελέτες ερυθροειδικών γονιδίων και microRNAs (miRNAs) σε φυσιολογικά ανθρώπινα πρόδρομα ερυθροκύτταρα διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης με σκοπό τη θέσπιση ενός ισχυρού ex-vivo μοντέλου ποσοτικοποίησης, ικανού για την μελέτη των γονιδίων και microRNAs που εμπλέκονται στα μονοπάτια των αιματολογικών παθήσεων

Τα Μεσογειακά σύνδρομα αποτελούν μία ετερογενή κατηγορία νοσημάτων η οποία χαρακτηρίζεται από τη μειωμένη σύνθεση των αλυσίδων αιμοσφαιρίνης ως αποτέλεσμα γενετικά καθορισμένων διαταραχών. Η σύνθεση της αιμοσφαιρίνης είναι μία πολύπλοκη και αυστηρώς ρυθμιζομενη διαδικασία που απαιτεί την παρουσία μεταγραφικών παραγόντων, cis-ρυθμιστικών αλληλουχιών και τροποποιητών χρωματίνης με σκοπό τη σωστή και ιστοειδική έκφραση των γονιδίων σφαιρίνης. Τα τελευταία χρόνια, μία νέα ομάδα μετα-μεταγραφικών ρυθμιστικών μορίων, τα microRNAs, έχουν αναγνωριστεί ως ρυθμιστικοί παράγοντες που εμπλέκονται ενεργά στην ερυθροειδική έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων. Η παρούσα διπλωματική εργασία είναι μία προκαταρτική μελέτη των ερυθροειδικών γονιδίων και microRNAs σε καθορισμένες χρονικές περιόδους ανάπτυξης των ex vivo φυσιολογικών πρόδρομων ερυθροκυττάρων με σκοπό την ανάπτυξη ενός ισχυρού ex vivo μοντέλου ποσοτικοποίησης, ικανού να μελετήσει τη μεταβολή των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων και microRNAs σε Μεσογειακά σύνδρομα και ειδικότερα σε περιπτώσεις ομόζυγης β0 – Μεσογειακής Αναιμίας. Στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα των φυσιολογικών ατόμων παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων και microRNAs κατά την αξιολόγηση των κυτταρικών καλλιεργειών σε καθορισμένες χρονικές περιόδους. Oι τιμές, επίσης, των λόγων έκφρασης μεταξύ των γονιδίων και των microRNAs δεν παρουσίαζαν στατιστικά σημαντική απόκλιση μεταξύ των χρονικών περιόδων αξιολόγησης, υποδεικνύοντας ότι οι λόγοι παραμένουν σταθεροί καθ’ όλη τη διάρκεια εξέλιξης της ερυθροποίησης. Ακολούθως, από τη σύγκριση πρόδρομων φυσιολογικών και θαλασσαιμικών ερυθροκυττάρων, παρατηρήθηκε υποέκφραση των γονιδίων και των microRNAs στα παθολογικά δείγματα σε σχέση με τα φυσιολογικά• αναδεικνύοντας μ’ αυτό τον τρόπο τη διαφορετική εικόνα έκφρασης των ρυθμιστικών μορίων και γονιδίων στις αιμοσφαιρινοπάθειες.The Thalassemia syndromes comprise a heterogeneous group of diseases characterized by decreased synthesis of the globin chains of hemoglobin, as a result of hereditary mutations in the genes coding for globin. The synthesis of hemoglobin is a highly regulated process that requires the interaction of many components, including transcription factors, cis-regulatory sequences and chromatin modifiers, ultimately supporting the correct timing and tissue-specific expression of globin genes. In recent years, a new group of post-transcriptional regulatory molecules, microRNAs, have been identified as yet another category of regulatory factors, potentially involved in expression of globin genes. This study represents a preliminary investigation of the expression of erythroid genes and microRNAs in defined periods of development ex- vivo erythroid cell cultures from normal individuals, with the aim of developing a robust ex- vivo quantification model, capable of investigating possible changes in the expression levels of microRNAs in Thalassemia syndromes, and particularly in homozygous β0 - Thalassemia. In erythrocyte precursors from normal individuals an increase of expression levels was observed for the erythroid-specific genes under study as well as the selected microRNAs, during the progression of the cell cultures. Also, there was no statistically significant difference in expression ratios between 4 mRNAs, or between the 2 microRNAs under study during cell culture progression. These results indicate that the expression ratios remains constant during the development of erythropoiesis in both normal and β0 – Thalassemia derived ex-vivo progenitor erythrocytes. In addition, an overall down-regulation of genes and microRNAs was observed in pathological samples compared to normal samples

Παρασκευή ερυθρών αιμοσφαιρίων για μετάγγιση από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα

Η μετάγγιση του αίματος μπορεί να θεωρηθεί μια μορφή μεταμόσχευσης αιμοποιητικού ιστού και οι πρώτες αναφορές της ξεκινούν το 17ο αιώνα μετά από την μελέτη του κυκλοφορικού συστήματος από τον William Harvey. Η έννοια της ανοσολογίας της μετάγγισης εισήχθη στις αρχές του 20ου αιώνα με την ανακάλυψη των ΑΒΟ ερυθροκυτταρικών αντιγόνων από τον Karl Landsteiner. Η εξέλιξη της μετάγγισης αίματος σε μια ασφαλή μορφή θεραπείας που εφαρμόζεται καθημερινά στην κλινική πράξη, οφείλεται σε ένα μεγάλο όγκο επιστημονικών μελετών οι οποίες θέσπισαν την εφαρμογή των αυστηρών ελέγχων που εφαρμόζονται σε όλα τα στάδια της μετάγγισης. Παρόλα αυτά, η μεταγγισιοθεραπεία σήμερα συνεχίζει να αντιμετωπίζει αρκετά προβλήματα που αφορούν όλες τις φάσεις της, από τη συλλογή του αίματος μέχρι τη χορήγησή του. Η ανεπάρκεια ικανού αριθμού δοτών, η μετάδοση παθογόνων μικροοργανισμών, η αλλοανοσοποίηση και το συνολικό κόστος της διαδικασίας, στρέφουν το επιστημονικό ενδιαφέρον προς την αναζήτηση εναλλακτικών μεθόδων μετάγγισης. Η ex vivo παραγωγή ερυθρών αιμοσφαιρίων δυνάμενων να αντικαταστήσουν μια μονάδα συμπυκνωμένων ερυθρών, αποτελεί μια ιδιαίτερα θελκτική προοπτική και ακόμα περισσότερο εντυπωσιακή είναι η ιδέα μιας μαζικής τέτοιας παραγωγής. Διάφορες επιστημονικές ομάδες εκμεταλλευόμενες τα χαρακτηριστικά των στελεχιαίων κυττάρων και την συνεχώς ανανεούμενη γνώση στους τομείς της συλλογής, της καλλιέργειας, της διατήρησης και της ανάπτυξης των κυττάρων αυτών, έχουν σημειώσει σημαντική πρόοδο προς την υλοποίηση μιας τέτοιας ιδέας. Και οι τρεις βασικές πηγές προέλευσης των στελεχιαίων κυττάρων (HSPCs, ESCs και iPSCs), θεωρούνται ικανές να δημιουργήσουν τεράστιες ποσότητες ερυθρών αιμοσφαιρίων. Με την περαιτέρω μελέτη και τελειοποίηση των πρωτοκόλλων παραγωγής in vitro ερυθροκυττάρων, προβλέπεται ότι τα οικονομικά και βιοτεχνολογικά εμπόδια των επί του παρόντος εφαρμοζόμενων μεθόδων, θα μπορέσουν να υπερκεραστούν πιθανά ακόμα και μέσα στα επόμενα δέκα χρόνια.Blood transfusion may be considered as a form of heamatopoietic tissue transplantation and its first reports began in the 17th century after William Harvey’s studies of blood circulation system. The concept of transfusion immunology was introduced at the beginning of the 20th century with the discovery of ABO blood group antigens by Karl Landsteiner. The evolution of blood transfusion into a safe form of treatment that is applied daily in clinical practice, is based on a large range of scientific studies that have established strict control systems which are applied at all stages of transfusion. However, transfusion therapy continues to face several problems concerning all phases, from the collection of the blood to its administration. The sufficiency of donors, the transmission of pathogenic microorganisms, the alloimmunization and the overall costs of the process, turn the scientific interest to the search for alternative transfusion methods. The ex vivo production of red blood cells capable of replacing a unit of packed red blood cells is a very attractive prospect, let alone the idea of a massive production of such a product. Various scientific groups, exploiting the stem cell characteristics and the constantly renewed knowledge in the fields of collection, culture, preservation and expansion of these cells, have made significant progress towards the realization of such an idea. All three major sources of stem cells (HSPCs, hESCs and iPSCs) are thought to be capable of generating enormous amounts of red blood cells. By further studying and refining of in vitro red cell production protocols, it is anticipated that the economic and biotechnological obstacles of the current methods will be overcome even within the next ten years

Ανάλυση αποτελεσμάτων Omics με στόχο τον προσδιορισμό βιοδεικτών

Η β-θαλασσαιμία είναι μια αιμοσφαιρινοπάθεια στην οποία παρατηρείται αναποτελεσματική ερυθροποίηση. Χαρακτηρίζεται από μεγάλο αριθμό μεταλλάξεων του γονιδίου της β-σφαιρίνης, οι οποίες μειώνουν τη σύνθεσή της. Ο φαινότυπος που παρουσιάζει η ασθένεια μπορεί να είναι ασυμπτωματικός, ενδιάμεσος (Thalassaemia Intermedia, TI) ή μείζων (Thalassaemia Major, TM) με διαφορετική θεραπευτική αντιμετώπιση (μεταγγίσεις αίματος, αποσιδήρωση και μεταμόσχευση μυελού). Η έγκαιρη κατηγοριοποίηση των ασθενών ως TI ή TM είναι σημαντική στην κλινική πράξη για την αποφυγή των μη απαραίτητων μεταγγίσεων και των επακόλουθων επιπλοκών τους στα άτομα με ενδιάμεσο φαινότυπο και την έγκαιρη έναρξη των μεταγγίσεων σε άτομα με μείζων θαλασσαιμία. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα γονιδιακής έκφρασης (RNASeq) 2999 στατιστικώς σημαντικών διαφορικώς εκφραζόμενων γονιδίων από 49 δείγματα (υγιών ατόμων και ασθενών με ενδιάμεση και μείζων θαλασσαιμία), τα οποία αναλύθηκαν με το εργαλείο GeneSrF που χρησιμοποιεί τον αλγόριθμο μηχανικής μάθησης “Τυχαίο Δάσος”. Το GeneSrF χρησιμοποιήθηκε για την ανακάλυψη γονιδίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εκπαίδευση του αλγορίθμου για τη διάκριση μεταξύ ασθενών και υγιών (Η) ατόμων οδηγεί σε μεγάλη αξιοπιστία στη διάκριση μεταξύ H & TI και μεγαλύτερη αξιοπιστία στη διάκριση μεταξύ H & TM ατόμων. Ωστόσο, η διάκριση μεταξύ των δειγμάτων ΤΙ και ΤΜ δεν ήταν εφικτή. Τέλος, η παρούσα εργασία εντόπισε γονίδια που θα ελέγχουν πειραματικά και πιθανώς να συνεισφέρει μελλοντικά στον προσδιορισμό βιοδεικτών για την αποτελεσματική κατηγοριοποίηση των θαλασσαιμικών ασθενών.β-Thalassaemia is a hemoglobinopathy characterized by ineffective erythropoiesis. A large number of mutations has been identified in the β-globin gene, resulting in reduced production of β-globin. The phenotype of a person with β-Thalassaemia can be asymptomatic, intermediate (Thalassaemia Intermedia – TI) or severe (Thalassaemia Major – TM). Each phenotype requires different therapeutic management (such as blood transfusion, iron chelation or bone marrow transplantation). Identification of molecular biomarkers for patient stratification is necessary to guide therapeutic decisions in clinical practice. In this study, gene expression data (RNA-Seq) from 2999 statistically significant differentially expressed genes from 49 individuals (Healthy, TI and TM) have been used to train a Random Forest machine learning tool named GeneSrf, to identify genes that distinguish different groups and might be used as biomarkers for patient stratification in thalassaemia. Our results show that RNA-Seq data does increase the success rate of the predictive model generated by the Random Forest algorithm to stratify TM vs H and TI vs H patients. However, stratification of TM vs TI patients was not possible. This study has identified genes that will be further experimentally validated and might be useful as biomarkers for efficient β-thalassaemia patient stratification

Η Συμμετοχή των miRNA στην Ερυθροποίηση και την έκφραση των γονιδίων Αιμοσφαιρίνης

Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος «Ιατρική Γενετική: Κλινική και Εργαστηριακή Κατεύθυνση» του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Αθηνών κατά τη διάρκεια του ακαδημαϊκού έτους 2019-2020 στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής της Ιατρικής Σχολής Αθηνών του ΕΚΠΑ. Πρόκειται για μία μελέτη ανάλυσης και συνδυασμού δεδομένων από βιβλιογραφικές πηγές πάνω στο θέμα «Η συμμετοχή των miRNA στην ερυθροποίηση και την έκφραση των γονιδίων αιμοσφαιρίνης». Αρχικά παρουσιάζονται συνοπτικά οι επιμέρους εισαγωγικές γνώσεις που αφορούν την περιγραφή των miRNA, την ερυθροποίηση και την διάταξη των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης με λεπτομερή αναφορά και των ποικίλων μορίων και παραγόντων που συμμετέχουν στην βιογένεση και δράση των miRNA. Στην συνέχεια, γίνεται αναφορά τόσο των in vitro, όσο και των in silico μεθόδων εξαγωγής πληροφοριών και επεξεργασίας των miRNA με εκτενή περιγραφή της qPCR μεθόδου και των βάσεων δεδομένων σε κάθε κατηγορία αντίστοιχα. Στο τρίτο κομμάτι της διπλωματικής περιγράφονται οι σχέσεις των ποικίλων δράσεων των miRNA με την διαδικασία της αιμοποίησης, με ειδική μνεία στην ερυθροποίηση, και με τα γονίδια των αιμοσφαιρινών, καθώς και των παθολογικών τους γονοτύπων και φαινοτύπων. Περιγράφονται οι πιο σημαντικοί εκπρόσωποι των miRNA, όπως τα miR-150, miR-223, miR-15a, miR-144, miR-451, που σχετίζονται τόσο με την ερυθροποίηση, όσο και με τα γονίδια των σφαιρινών, ανάλογα με τη σχέση που έχουν με τα πιο σημαντικά γονίδια της ερυθροποίησης και των σφαιρινικών αλυσίδων. Τέλος, γίνεται συνοπτική αναφορά σε παθολογικές περιπτώσεις όπως η β-θαλασσαιμία και εξάγονται γενικότερα συμπεράσματα για την δράση των miRNA στην έρευνα, στην διάγνωση, στην θεραπεία, και γίνονται υποθέσεις για την μελλοντική δράση τους.This dissertation was conducted under the aegis of the National and Kapodistrian University of Athens, as part of the Master’s Program “Medical Genetics: Clinical and Laboratory Direction” for the academic year 20192020. It is a bibliographic dissertation which focuses on the analysis and comparison of existing literature with regards to the contribution of miRNAs in erythropoiesis and expression of hemoglobin genes. Firstly, the necessary introductory information is presented, concerning erythropoiesis and hemoglobin’s gene sequence, discussing the various molecules and other factors which contribute to the biogenesis and function of miRNAs. Secondly, all in silico and in vitro methods of miRNA processing are presented, thoroughly explicating both the qPCR method and the various miRNA databases. In the third segment of the present work, the miRNAs that contribute to the procedure of the hematopoiesis, and more specifically that of erythropoiesis, are presented along with the most representative miRNAs connected to the hemoglobin genes and their pathological variants. Thus, miRNAs such as miR150, miR-223, miR-15a and miR-451, which are related both with erythropoiesis and hemoglobin genes are of great importance. Lastly, there is brief mention of pathological cases, such as β-thalassemia, and conclusions regarding the function of miRNAs in research, diagnosis and therapy are drawn, along with hypotheses about their future contribution

Αιμοσφαιρινοπάθειες και καρδιαγγειακά νοσήματα

Εισαγωγή: Τα καρδιαγγειακά προβλήματα σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική νόσο είναι συχνά και εξακολουθούν να αποτελούν την κύρια αιτία θνησιμότητας και νοσηρότητας. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η εκτίμηση των υπερηχογραφικών καρδιολογικών μεταβολών σε ασθενείς πασχόντων από αιμοσφαιρινοπάθειες Υλικό και Μέθοδος: Το δείγμα της μελέτης αποτέλεσαν 52 ασθενείς, με μέση ηλικία 45 ετών, με αιμοσφαιρινοπάθειες που παρακολουθούνταν στο Γενικό Νοσοκομείο Αθηνών «ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ» από τον Σεπτέμβριο του 2021 έως τον Ιανουάριο του 2022 .Τα στοιχεία συλλέχθηκαν κατά τον περιοδικό έλεγχο των ασθενών, όπου υποβάλλονταν σε υπερηχογραφικό έλεγχο. Αποτελέσματα: Από τα 52 άτομα του δείγματος το 65,4% ήταν γυναίκες. Το 43% του δείγματος ήταν ασθενείς με μείζων β -μεσογειακή αναιμία και το 19,2% με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Το 30,8% ανέφερε ότι πάσχει από κάποιο καρδιολογικό πρόβλημα, ενώ το 59,6% από κάποιο άλλο συνοδό νόσημα. Το 19,2% αναφέρει υπέρταση, το 7,7% καρδιακή ανεπάρκεια, πνευμονική υπέρταση το 17,3% ,το 5,8% κολπική μαρμαρυγή και ανεπάρκεια βαλβίδων το 61,5%. Οι ασθενείς με β μεσογειακή αναιμία και ενδιάμεση θαλασσαιμία έχουν μεγαλύτερη τιμή συστολικής πίεσης στην πνευμονική αρτηρία p=0,021 ομοίως και στην τιμή της διαμέτρου της δεξιάς κοιλίας p=0,040. Οι ασθενείς με ηλικία 46-67 ετών έχουν μεγαλύτερη διάμετρο μεσοκοιλιακού διαφράγματος p=0,004, μεγαλύτερη διάμετρο αριστερού κόλπου p=0,006 και μεγαλύτερη διάμετρο αορτικής ρίζας p=0,001. Οι ασθενείς επίσης, που έχουν υποβληθεί σε σπληνεκτομή έχουν μεγαλύτερη διάμετρο αορτικής ρίζας p=0,037, μεγαλύτερη συστολική πίεση στην πνευμονική αρτηρία p=0,047 και μεγαλύτερη διάμετρο δεξιάς κοιλίας p=0,009.Οι ασθενείς με ανεπάρκεια βαλβίδων έχουν μεγαλύτερη διάμετρο αριστερής κοιλίας p=0,008 και μεγαλύτερη διάμετρο αριστερού κόλπου p=0,019 . Οι πάσχοντες με πνευμονική υπέρταση, έχουν μεγαλύτερη διάμετρο αριστερής κοιλίας p=0,009, μεγαλύτερη διάμετρο δεξιάς κοιλίας p=0,021 και μεγαλύτερη πίεση στην πνευμονική αρτηρία p=0,006 Συμπεράσματα: Στο δείγμα της παρούσας μελέτης δεν κατεγράφησαν χαρακτηριστικά σοβαρής καρδιαγγειακής νόσου όσον αφορά την υπερυχογραφική μελέτη. Η συχνότερη υπερυχογραφική παθολογική καταγραφή ήταν η μικρή ανεπάρκεια της μιτροειδούς βαλβίδας ενώ πνευμονική υπέρταση κατεγράφη σε μικρό ποσοστό των ασθενών.Introduction: Cardiovascular problems in patients with beta-thalassemia and sickle cell disease are common and continue to be the leading cause of mortality and morbidity. Aim: The aim of the present study is to evaluate the ultrasound cardiac changes in patients suffering from haemoglobinopathies Material and Methods: The sample of the study consisted of 52 patients, with an average age of 45 years, with hemoglobinopathies who were followed up at the Athens General Hospital "IPOKRATEIO" from September 2021 to January 2022.The data were collected during the periodic check-up of the patients, where they underwent ultrasound examination. Results: Of the 52 subjects in the sample, 65.4% were female. 43% of the sample were patients with major beta-thalassemia and 19.2% with sickle cell anemia. 30.8% reported suffering from a cardiac problem, while 59.6% reported some other concomitant disease. 19.2% reported hypertension, 7.7% heart failure, 17.3% pulmonary hypertension ,5.8% atrial fibrillation and 61.5% valve failure. Patients with beta thalassemia and intermediate thalassemia have higher value of systolic pulmonary artery pressure p=0.021 similarly right ventricular diameter p=0.040. Patients aged 46-67 years have a larger interventricular septum diameter p=0.004, larger left atrial diameter p=0.006 and larger aortic root diameter p=0.001. Patients who have also undergone splenectomy have a larger aortic root diameter p=0.037, larger pulmonary artery systolic pressure p=0.047 and larger right ventricular diameter p=0.009.Patients with valve regurgitation have a larger left ventricular diameter p=0.008 and larger left atrial diameter p=0.019 . Patients with pulmonary hypertension, have a larger left ventricular diameter p=0.009, larger right ventricular diameter p=0.021 and larger pulmonary artery pressure p=0.006 Conclusions: No features of severe cardiovascular disease were recorded in the sample of the present study with regard to the ultrasonographic study. The most common ultrasonographic pathological recording was minor mitral valve regurgitation while pulmonary hypertension was recorded in a small percentage of patients

Υπολογιστική Ανάλυση παθολογιών γονάτου με την χρήση εικόνων MRI

Η αρθρίτιδα είναι μία παθολογική κατάσταση η οποία εμφανίζεται πολύ συχνά όχι μόνο σε άτομα προχωρημένης ηλικίας αλλά και σε σχετικά νεαρά άτομα. Το οστικό οίδημα αποτελεί το αποτέλεσμα ενός τραυματισμού. Για την διάγνωση αυτών των παθολογιών χρησιμοποιείται η μαγνητική τομογραφία. Στα πλαίσια ενός πρωτοκόλλου ρουτίνας συμπεριλαμβάνονται οι ακολουθίες STIR που είναι μια κατεξοχήν ακολουθία καταστολής λίπους και Proton Density (PD) fat saturation (FS) δηλαδή PD με επιλεκτικό φασματικό κορεσμό του λίπους. Η κάθε κατηγορία σε αυτές τις ακολουθίες απεικονίζεται με υψηλό σήμα. Σκοπός της εργασίας είναι να δημιουργηθεί ένα υπολογιστικό σύστημα το οποίο θα χρησιμοποιεί τεχνικές ανάλυσης ψηφιακής εικόνας για την αποτίμηση της διαφοροποίησης μεταξύ εικόνων MRI σε γόνατα από φυσιολογικό μυελό των οστών, αρθρίτιδας και οστικού οιδήματος από τραυματισμό. Η μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε περιλαμβάνει αρχικά την χειροκίνητη επιλογή των περιοχών ενδιαφέροντος. Στη συνέχεια, εξήχθησαν από κάθε περιοχή ενδιαφέροντος 12 χαρακτηριστικά για το χρώμα και την υφή (στατιστικά χαρακτηριστικά 1ης τάξης, 2ης τάξης) και έγινε αναζήτηση των χαρακτηριστικών εκείνων που προσφέρουν διαφοροποίηση μεταξύ των τριών κατηγοριών (φυσιολογικός μυελός, αρθρίτιδα, οστικό οίδημα από τραυματισμό). Η μεθοδολογία δοκιμάστηκε σε 92 περιστατικά (29 με φυσιολογικό μυελό των οστών, 31 με οστικό οίδημα από κάκωση και 38 από οστεοαρθρίτιδα) από το ΑΝΙΜΟΥΣ ΚΥΑΝΟΣ ΣΤΑΥΡΟΣ. Από το αρχικό πλήθος των 12 χαρακτηριστικών εφαρμόστηκε το κριτήριο rank-features ως μέθοδος επιλογής χαρακτηριστικών. Για την ταξινόμηση των δειγμάτων υλοποιήθηκε ο ταξινομητής Cubic SVM. Τα καλύτερα αποτελέσματα προέκυψαν με χρήση της STIR ακολουθίας. Συγκεκριμένα, όσον αφορά στον διαχωρισμό μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών (οστεοαρθρίτιδα και οίδημα από κάκωση), το ποσοστό ακριβείας έφθασε στο 75.50% με χρήση των χαρακτηριστικών τυπική απόκλιση, ενέργεια, εύρος συσχέτισης, ομοιογένεια, εύρος αντίθεσης ασυμμετρία, εύρος ομοιογένειας και αντίθεση. Για για τον διαχωρισμό μεταξύ φυσιολογικού μυελόυ και οιδήματος από κάκωση τα καλύτερα χαρακτηριστικά ήταν ενέργεια, εύρος συσχέτισης, τυπική απόκλιση, ομοιογένεια, ασυμμετρία, εύρος αντίθεσης, αντίθεση, και το μεγαλύτερο ποσοστό ακρίβειας ήταν 68.30%. Για τον διαχωρισμό μεταξύ φυσιολογικού μυελού και οστεοαρθρίτιδας εξήχθησαν τα χαρακτηριστικά τυπική απόκλιση, ενέργεια, εύρος συσχέτισης, ομοιογένεια, κύρτωση, μέση τιμή και το ποσοστό ακριβείας ήταν 70.10%. Τέλος, το καλυτερό ποσοστό ακρίβειας για τον διαχωρισμού μεταξύ των δύο κατηγοριών παθολογίας ήταν 65.20% με χρήση των χαρακτηριστικών μέση τιμή, ασυμμετρία, συσχέτιση, αντίθεση.Arthritis is a pathological condition that occurs a very big range of people not only in the elderly but also in young people. An injury can be a cause of a bone marrow edema. Magnetic Resonance Imaging is used to diagnose these pathologies. Short Tau Inversion Recovery (STIR) sequences and Proton Density (PD) with fat saturation (FS) sequence, i.e. PD with selective spectral saturation of fat are included in a knee routine examination protocol. Each category in these sequences is represented by a high signal. The aim of this thesis is to create a computational system that will use digital image analysis techniques to measure the differentiation between normal MRI bone marrow erythropoiesis, arthritis and bone edema from injury. The methodology that will be used will initially include the manual selection of interest areas (ROIs). Then, from each ROI 12 color and texture features were extracted (e.g. 1st class, 2nd class statistics, etc.) and a feature selection process was apply to to isolate the features that provide differentiation between the three categories (normal marrow, arthritis, bone edema from injury). The methodology was tested on 92 cases (29 bone marrow erythropeisis, 31 injury, 38 osteoarthritis) from ANIMOUS KYANOS STAYROS. From the initial set of 12 features, the rank-features criterion was applied as a method of selecting features. The Cubic SVM classifier was used to classify the samples. In particular, with regard to the separation between normal and pathological (osteoarthritis and edema from injury), the accuracy rate reached 75.50% using the features standard deviation, energy, correlation range, homogeneity, contrast range, skewness, homogeneity range and contrast. For the discrimination, between normal marrow and edema from injury the best features were energy, correlation range, standard deviation, homogeneity, skewness, contrast range, contrast, and the highest accuracy rate was 68.30%. For the separation between normal marrow and osteoarthritis the features standard deviation, energy, correlation range, homogeneity, kurtosis, mean value reached the percentage of 70.10%. Finally, the best accuracy rate for the separation between the two categories of pathology was 65.20% using typical mean values, skweness, correlation, contrast

Πρωτεωμική προσέγγιση στην ανάλυση ρυθμιστικών σηματοδοτικών πορειών: ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες

Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός νέων πρωτεϊνικών συμπλόκων του ερυθροποιητικού μεταγραφικού παράγοντα GATA-1, μέσω της εφαρμογής της μεθόδου in vivo βιοτινυλίωσης σε σύζευξη με φασματομετρία μάζας. Προκειμένου να γίνει ο χαρακτηρισμός των νέων πρωτεϊνικών συμπλόκων, βελτιώσαμε τη μέθοδο της in vivo βιοτινυλίωσης η οποία περιλαμβάνει την ομοιοπολική πρόσδεση βιοτίνης σε μια βραχεία αμινοξική αλληλουχία (15-23 αα) συζευγμένη με την υπό μελέτη πρωτεΐνη και την μετέπειτα κατακρήμνιση της βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης από σφαιρίδια στρεπταβιδίνης. Η βελτιωμένη μέθοδος οδήγησε στην ταυτοποίηση νέων αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών με τη GATA-1 όπως και ένα αριθμό πρωτεϊνών που κατακρημνίζονται μη ειδικά εξαιτίας της ύπαρξης νουκλεϊκών οξέων στα πυρηνικά εκχυλίσματα και οι οποίες είναι ικανές να οδηγήσουν στη ταυτοποίηση ψευδών θετικών αλληλεπιδράσεων. Ως ένα τέτοιο παράδειγμα ψευδούς θετικής αλληλεπίδρασης, παρουσιάζεται η αλληλεπίδραση της GATA-1 με τις πρωτεΐνες TAF, ενώ παρουσιάζονται και αποτελέσματα που δείχνουν ότι η χρήση ειδικών νουκλεασών για την διάσπαση των νουκλεϊκών οξέων σε πυρηνικά εκχυλίσματα μειώνει αισθητά τις μη ειδικές πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Επίσης, από τα αποτελέσματα της φασματομετρίας μάζας αναγνωρίσθηκε η DNA μεθυλοτρανσφεράση Ι ως αλληλεπιδρώσα με τη GATA-1 πρωτεΐνη μαζί με τους μεταγραφικούς παράγοντες ZBP-89 και ZNF143. Η ύπαρξη του συγκεκριμένου συμπλόκου επιβεβαιώθηκε από σειρά πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης. Με τη χρήση απαλειπτικών μεταλλάξεων της DNMT-1 βρέθηκε η περιοχή PBD ως υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο GATA-1/ZBP-89/ZNF143. Ο χαρακτηρισμός της περιοχής που είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση επιτρέπει τη διατάραξη του πρωτεϊνικού συμπλόκου με σκοπό τη διασαφήνιση της λειτουργικής σημασίας του πρωτεϊνικού συμπλόκου και του σκοπού που επιτελεί στην ερυθροποίηση.GATA-1 is a key hematopoietic transcription factor that is required for erythrocyte differentiation. GATA-1 can positively or negatively regulate erythroid genes through its ability to form multiple protein complexes. In this thesis we sought to discover new GATA-1 protein complexes by using improved in vivo biotinylation tagging coupled to mass spectrometry. In vivo biotinylation involves the covalent attachment of a biotin group to a small peptide tag (15-23 aa) fused to the protein of interest, by the bacterial biotin ligase BirA and the very high affinity binding of the biotin-tagged protein by streptavidin. We show that including Nonidet P-40 in the nuclear extract preparation reduces background caused by the binding of endogenously biotinylated proteins. We also show that the use of alternative nuclear extract methods, results in more efficient nuclear protein extraction of GATA-1 protein compared to the commonly used high salt extraction method. By using this improved biotinylation tagging method we identify the novel interacting GATA-1 protein DNA methyltransferase I while being able to discard false positive identified interactions. We present an example of the latter by showing how GATA-1 interactions with TAF proteins as identified by mass spec, disappear upon nuclease digestion of nucleic acids from the nuclear extracts. By applying the biotinylation tagging approach for the reverse purification of DNMT1 protein complexes, we confirmed the interaction with GATA-1 and we further identified novel interactions with key hematopoietic transcription factors such as ZBP-89, ZNF143, Gfi-1b, FOG-1 and others. Validation of these interactions further suggested that DNMT1 forms a core complex with ZBP-89 and ZNF143 and subcomplexes with GATA-1, FOG-1 and Gfi-1b. In order to map the DNMT-1 domains necessary for the interaction with transcription factors, DNMT1 deletion mutants of the protein were used to show that the domain responsible for interaction is the PCNA binding domain (PBD). This will be further used in order to unravel the biological significance of the GATA-1 DNMT-1 interaction

Αξιολόγηση της νέας παραλλαγής c.92+7A>G (IVS-I-7A>G) στο γονίδιο της β-σφαιρίνης (ΗΒΒ) μέσω μελέτης RNA με RT-PCR σε ανώριμα ερυθρά κύτταρα

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι μια ετερογενή ομάδα μονογονιδιακών νοσημάτων που προκύπτουν από μεταλλάξεις στα γονίδια των σφαιρινών στον άνθρωπο. Λόγω της μεγάλης συχνότητας των φορεών τους παγκοσμίως, αποτελούν το πιο κοινό μονογονιδιακό νόσημα. Χαρακτηρίζονται από διαταραχές στη σύνθεση και τη δομή των υπομονάδων της αιμοσφαιρίνης. Η β-θαλασσαιμία είναι ένα αυτοσωμικό υπολειπόμενο νόσημα που είναι αποτέλεσμα απουσίας ή μειωμένης σύνθεσης της β-αλυσίδας. Περισσότερες από 200 μεταλλάξεις που σχετίζονται με την β-Θαλασσαιμία έχουν περιγραφεί και η πλειοψηφία τους αφορά σημειακές μεταλλάξεις, μεταξύ άλλων και ένα ευρύ φάσμα μεταλλάξεων που εμπλέκονται στην επεξεργασία του πρόδρομου mRNA, επηρεάζοντας τη φυσιολογική συρραφή. Η παρούσα εργασία σκοπεύει στη διερεύνηση της παθογένειας μιας καινούρια παραλλαγής c.92+7A>G (IVS-I-7A>G) στο γονίδιο της β-σφαιρίνης. Η συγκεκριμένη παραλλαγή ταυτοποιήθηκε σε ένα παιδί με αιματολογικά ευρήματα για πιθανή εκδήλωση ενδιάμεσης β-Θαλασσαιμίας και επίσης, κληρονόμησε σε trans μια κοινή μετάλλαξη για β-Θαλασσαιμία, την HBB:c.118C>T. Η αξιολόγηση της παθογένειας βασίζεται σε μια πλειάδα παραμέτρων στις οποίες περιλαμβάνονται οι μελέτες οικογενειακού διαχωρισμού, οι μελέτες πληθυσμιακής συχνότητας, in-silico προγράμματα και σε πειραματικές μελέτες. Οι προσεγγίσεις αυτές περιλαμβάνονται σε κατευθυντήριες οδηγίες όπως αυτές του ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics). Η παραλλαγή HBB:c.92+7A>G εδράζεται κοντά στη θέση δότη του εξονίου 1του β-γονιδίου και πιθανά να επηρεάζει τη συρραφή του μετάγραφου του β-γονιδίου. Με βάση αυτή την υπόθεση, διερευνήθηκε η ύπαρξη μη φυσιολογικά συρραμένου mRNA σε πρόδρομα ερυθροκύτταρα τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα RNA των σφαιρινών. Μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος του υπό μελέτη ατόμου και του πατέρα του, που ήταν ετερόζυγος για την παραλλαγή c.92+7A>G, καθώς και δείγματα από άτομο με φυσιολογική εικόνα σε σχέση με τις αιμοσφαιρινοπάθειες, απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν. Απομονώθηκε το συνολικό RNA από τα ανώριμα ερυθροκύτταρα και πραγματοποιήθηκε αντίστροφης μεταγραφής PCR (reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR). Για να διαπιστωθεί η ύπαρξη προϊόντων από μη φυσιολογική συρραφή, χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακριλαμίδης (polyacrylamide gel electrophoresis ,PAGE), αλληλούχιση και PCR με φθορίζοντα εκκινητή (F-PCR). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις μεθόδους PAGE και αλληλούχισης, δεν παρουσίασαν κάποιο παραπροϊόν από μη φυσιολογική συρραφή. Από την F-PCR, μόνο από το ένα ζευγάρι εκκινητών ανιχνεύθηκε μια πολύ μικρή κορυφή που πιθανά θα μπορούσε να ανήκει σε μη φυσιολογικά συρραμένου RNA. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα δεν οδηγούν σε σίγουρο συμπέρασμα, υποδεικνύοντας τις προκλήσεις που χαρακτηρίζουν την παθογένεια των νέων παραλλαγών στο DNA.Hemoglobinopathies are a heterogenous group of monogenic diseases resulting from mutations in the globin genes. Due to high carrier frequencies worldwide, they consist the commonest monogenic disorders. They are characterized by abnormal synthesis and structure of hemoglobin chains. β-Thalassemia is inherited in autosomal recessive manner and it is resulted from absent or reduced synthesis of β-chain. More than 200 mutations of β-Thalassemia have been described and most of them are point mutations. A wide variety of mutations interfere with mRNA processing which affected the normal splicing. The present thesis aimed to investigate the pathogenicity of a novel variant HBB:c.92+7A>G (IVS-I-7A>G). The variant was identified in a child with hematological findings indicative of a possible state of β-Thalassemia Intermediate who had also inherited in trans a common typical beta-thalassemia mutation HBB:c.118C>T (traditionally called codon 39C>T). The evaluation of the pathogenicity of novel DNA variants is challenging and very important in the light of the new DNA technologies such as next-generation sequencing. The evaluation of pathogenicity can be based on many parameters including family segregation studies, population frequency studies, in-silico model studies and finally experimental studies; these approaches are incorporated into various guidelines, such as those of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). The specific variant HBB:c.92+7A>G is located very close to the donor splice site of exon 1 of HBB. Thus it could potentially affect splicing of the beta-globin RNA transcript. Based on this assumption, investigating the presence of abnormally spliced mRNA of red-cell precursors which express very high levels of globin RNA. To this end mononuclear cells from peripheral blood from the proband and his father, who was heterozygous for the novel variant HBB:c.92+7A>G were isolated and cultured. The total RNA was isolated from the precursor erythroid cells and reverse transcription PCR (RT-PCR) was performed. To determine the present of aberrantly spliced RNA, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), sequencing and Fluorecence PCR (F-PCR) were used. Based on the results of analysis using by PAGE and Sanger sequencing no abnormally spliced beta-globin mRNA were detected. However, the analysis of beta-globin mRNA transcripts using fragment analysis of fluorescently labeled RNA indicated a very small peak which could represent a tiny amount of abnormally spliced RNA. Overall, the results are inconclusive, highlighting the challenges of characterizing the pathogenicity of novel DNA variants