Investigation Of Interleukin-10 (il-10) Production from Helicobacter-activated Il-10+ B Cells On Molecular Level

Abstract

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2014Helikobakter pilori (H.pilori) gram-negatif, spiral yapıda, mikroaerofilik bir bakteri olmakla beraber gastritten mide kanserine kadar uazanan gastrik patolojilerin temel risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Dünya nüfusunun yaklaşık %50’si H.pilori ile enefektedir. Bu oran gelişmekte olan ülkelerde %80’e çıkabilmektedir. Ancak dünya genelinde enfekte olan kişi sayısı oldukça fazla olmasına karşın, enfekte bireylerin yalnızca % 20’sinde ise peptik ülser, MALT lenfoma ve mide kanseri gibi patolojiler görülmektedir. Enfekte bireylerin büyük bir kısmı herhangi bir semptom göstermemektedir. İnterlökin-10 (IL-10) patojenlere karşı oluşan immün cevabı baskılaması ve dolayısıyla patojene karşı oluşacak immün cevap esnasında üretilebilecek pro-inflamatuvar sitokinlerin aşırı inflamasyon nedeniyle konağa zarar vermesini engellemesi ile anti-inflamatuvar özellik gösteren bir sitokindir. B ve T hücrelerinin IL-10 üreten regülatör alt tipleri olduğu bilinmektedir. Güncel araştırmalar, Helikobakter felis (H.felis) enfeksiyonu fare modellerinde IL-10 üreten B hücrelerinin immün cevabı baskılayıcı ve düzenleyici rolü olduğunu ortaya koymuştur. H.felis, H.pilori ile aynı aileden gelmektedir ancak farelerde immün cevap oluşturma olasılığı daha yüsek olduğundan fare modellerinde kullanılmaktadır. Reseptörlere bağlanan ligandlar aracılığı ile alınan sinyaller hücre içinde çeşitli yollardan iletilmektedir. Hücre içi sinyal yolakları tarafından iletilen uyarı, sinyale uygun bir cevap verilmesini sağlamaktadır. IL-10 üreten Helikobakter-aktive B hücrelerinden IL-10 salınımının Toll-benzeri reseptör 2 (TLR2) aracılığıyla sağlandığı yakın zaman önce gösterilmiştir. Doğal bağışıklık sisteminin antijen sunan hücreleri olan makrofajlar ve dendritik hücrelerden TLR-uyarımı ile IL-10 üretilmektedir. Bu hücrelerden IL-10 üretim ve salınımının mitojen aktive protein kinaz (MAPK), fosfatidilinositol-3 kinaz (PI3K) ve nükleer faktör-kappa B (NF-κB) sinyal yolakları aracılığıyla olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla, bu çalışmada incelenen önemli hücre içi sinyal iletim yolları MAPK, PI3K ve NF-κB sinyal yolaklarıdır. Hücre içi sinyal iletiminde bir çok protein görev almaktadır. Enzimatik reaksiyonla kendinin veya başka proteinlerin fosforilasyonunu sağlayan proteinler kinaz adını almaktadır. Bahsedilen sinyal iletim mekanizmaları bir çok kinazın aktivitesini gerektirmektedir. İlgili yolaklar bir dizi kinazın fosforilasyonunun ardından sinyal yolağını tetikleyen sinyale uygun immün cevap oluşturmak amacıyla nükleusa gidecek ve ilgili gen bölgesine bağlanarak immün cevapla ilintili gen veya genlerin transkripsiyonunu sağlayacak çeşitli transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuna neden olurlar. MAPK sinyal kaskadında IL-10 üretiminde rol oynadığı gösterilen iki kinaz p38 MAPK ve p44/42 MAPK (ERK-1/2)’dır. PI3K sinyal yolağında sinyal iletimi Akt kinazın fosforilasyonu aracılığıyla gerçekleşmektedir. CREB (siklik AMP tepki elemanı bağlayıcı protein) ise bahsedilen sinyal yolakları tarafından aktive olduğu bilinen ve makrofajların IL-10 transkripsiyonunda aktif rol alan bir transkripsiyon faktörüdür. Hücre içi sinyal yolaklarında bir sinyal molekülünün fosforilasyonu genel olarak aktivasyonu anlamına gelmektedir. Diğer bir deyişle MAPK ve PI3K sinyal yolaklarının aktivasyonu p38 MAPK, ERK-1/2, Akt ve CREB fosforilasyonuna bakılarak tayin edilebilir. NF-κB klasik sinyal yolağında ise p65 sinyal molekülünün fosforilasyonu aktivasyon ile ilintilidir.  Makrofajlar, dendritik hücreler ve T hücreleri gibi bağışıklık sistemi hücrelerinde IL-10 üretiminde rol oynayan hücre içi sinyal yolakları karakterize edilmiş olmasına karşın, TLR2-aracılığı ile aktive olan B hücrelerinde IL-10 üretimini sağlayan hücre içi sinyal yolakları bilinmemektedir. Helikobakter-aktive IL-10+ B hücrelerinin Helikobakter-aracılıklı mide patolojisini önlemede önemli bir katkısı olduğu bilinmektedir. Helikobakter-aktive IL-10+ B hücrelerinden IL-10 üretiminde rol oynayan sinyal iletim yolaklarının tespiti, ilgili hücrelerin kullanılacağı immün tedavi araştırmalarına da zemin hazırlaması bakımından önem teşkil etmektedir. Bu nedenle, bu çalışmanın odak noktası B hücrelerinin TLR2-uyarımı ile IL-10 üretmesini sağlayan hücre içi sinyal yolaklarının tespit edilmesidir. Bu amaçla, C57BL/6 dalağından elde edilen naif B hücreleri H.felis sonikatı ile uyarılmış ve ilgili hücrelerden TLR2-aracılıklı IL-10 üretimi ve salınımı gerçekleşmesi sağlanmıştır. Ardından H.felis sonikatı ile uyarılmış B hücreleri IL-10 üretme kapasitelerine göre manyetik yöntemle ayrılmış ve IL-10 negatif (IL-10- B hücreleri) ve IL-10 pozitif (IL-10+ B hücreleri) fraksiyonlar elde edilmiştir.   Fare-kaynaklı naif B hücreleri, H.felis sonikatı ile uyarılmış B hücreleri, Helikobakter-aktive IL-10- B ve IL-10+ B hücrelerinden elde edilen protein örnekleri MAPK, PI3K ve NF-κB yolaklarında kilit rol oynayan sinyal moleküllerinin  fosforilasyonu açısından incelenmiştir. İlgili sinyal moleküllerinin fosforilasyonları total ve fosforile formlarını tanımak için özelleşmiş antikorlar kullanılarak Western blotlama yöntemi ile tayin edilmiştir. NF-κB klasik sinyal yolağında önemli rol oynayan p65 sinyal molekülünün fosforilasyonu ise sinyal yolağı protein ELISA yöntemi ile tayin edilmiştir. Fosforilasyon tayininin ardından, hücre içi yolaklarda görev alan kinazların aktivitesini baskılayan spesifik inhibitörler yardımıyla ilgili yolakların bloklanması sonucu Helikobakter-aktive B hücrelerinden IL-10 salınımındaki değişim incelenmiştir. Bu sayede, baskılanan sinyal yolağının IL-10 üretimindeki etkisinin anlaşılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, fare-kaynaklı naif B hücreleri ve H.felis sonikatı ile uyarılmış B hücrelerinin MAPK sinyal yolağının p38 MAPK modülü ve  ERK-1/2 modülü, PI3K sinyal yolağı ve NF-κB klasik sinyal yolakları kimyasal inhibitörler kullanılarak bloklanmıştır. Ardından hücre üst-fazları toplanmış ve hücre üst-fazlarındaki IL-10 miktarı IL-10 ELISA yöntemi uygulanarak kantitatif olarak belirlenmiştir.  Helikobakter-aktive IL-10+ B hücrelerinden IL-10 üretimini ve salınmasını sağlayan hücre içi sinyal yolaklarının incelenmesi ve belirlenmesini amaçlayan çalışmanın sonucunda elde edilen verilere gore Helikobakter-aktive IL-10- B ve IL-10+ B hücre örnekleri arasında yapılan karşılaştırma sonrasında ERK-1/2 proteinlerinin Helikobakter-aktive IL-10+ B hücrelerinde anlamlı düzeyde daha fazla fosforile olduğu görülmüştür. İncelenen diğer kinazların (p38 MAPK ve Akt) ise Helikobakter-aktive IL-10- B hücre örneklerinde anlamlı düzeyde daha fazla fosforile olduğu gözlemlenmiştir. NF-κB sinyal proteini olan p65’in fosforilasyonunun ise örnekler arasında belirgin bir artış veya azalış göstermediği tespit edilmiştir. Bu durum ERK-1/2 aktivasyonunun Helikobakter-aktive B hücrelerinden IL-10 üretiminde daha etkin rol oynuyor olabildiğini düşündürmüştür. Bunun yanı sıra, spesifik inhibitörler kullanılarak bloklanmış sinyal iletim yolaklarının IL-10 salınımı üzerindeki etkisinin araştırılması sonucunda yalnızca ERK-1/2 inhibisyonunun B hücrelerinden IL-10 salınımında anlamlı bir azalışa yol açtığı görülmüştür. Bu bulgu da Helikobakter-aktive B hücrelerinden IL-10 üretiminde MAPK sinyal yolağı modülü olan ERK’in etkin rolü olduğu hipotezini güçlendirmektedir. Bu çalışma B hücrelerinden TLR2-aracılıklı IL-10 üretiminde etkili hücre içi sinyal yolaklarını aydınlatması ve MAPK sinyal iletim yolağının ERK-1/2 modülünün Helikobakter-aktive B hücrelerinden IL-10 üretimindeki rolünü göstermesi açısından önemlidir.Helicobacter pylori (H.pylori) is a gram-negative, spiral-shaped, microaerophilic bacterium that is defined to be a common risk factor for development of gastric malignancies that may lead to gastric cancer. Approximately 50% of the world’s population is infected with H.pylori. The prevalence of H.pylori infection goes up to 80% in developing countries. Although majority of world population is infected, only 20% of infected individuals may develop  peptic ulcer, MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) lymphoma and gastric adenocarcinoma. Majority of infected individuals are asymptomatic. Anti-inflammatory cytokine interleukin-10 (IL-10) represses immune response against pathogens and attenuates damage to host which may occur due to excessive inflammation. B and T cells are known to have regulatory subtypes. Recent researches indicate that IL-10 producing B cells have suppressive and immune regulatory role in mouse models of Helicobacter felis infection. Helicobacter felis (H.felis) is closely related to Helicobacter pylori. Helicobacter felis is widely used in animal models since it has higher immunogenicity for mice.  The signals received through ligands binding to their cognate receptors on cell surface are relayed by various intracellular signaling routes. The signal relayed through intracellular signaling pathways elicits a cellular response proper for the stimuli. It has been recently reported that IL-10 is produced and secreted through Toll-like receptor 2 (TLR2) signaling in Helicobacter-activated IL-10 producing B cells. It is known that TLR-mediated IL-10 secretion is maintained through MAPK (mitogen-activated protein kinase), PI3K (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) and NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) signaling pathways in macrophages and dendritic cells, antigen presenting cells of the innate immune system. Fundamental intracellular signaling pathways that are investigated in this study are therefore MAPK, PI3K and NF-κB signal transduction pathways.  There are many proteins that that part in intracellular signal transduction. Proteins that enable phosphorylation of themselves and other proteins by enzymatic reactions are termed as kinases. Aforementioned intracellular signaling pathways require activity of many kinases. These pathways induce sequential phosphorylation of protein kinases which leads to activation of various transcription factors that will translocate into nucleus and initiate transcription of genes related to proper cellular response to the stimuli. Phosphorylation of two protein kinases of MAPK signaling pathway, p38 MAPK and p44/42 MAPK (ERK-1/2) were shown to be required for induction of IL-10 production. PI3K signaling pathway requires phosphorylation of Akt. These separate pathways induce the phosphorylation, thereby activation of downstream signaling molecules such as CREB (cAMP response element-binding protein) which leads to IL-10 expression in macrophages. Phosphorylation of each element in intracellular signaling pathway is generally closely related with their activation status. Therefore, activation of MAPK and PI3K signaling pathways can be determined by investigating phosphorylation status of p38 MAPK, ERK-1/2, Akt and CREB. For activation check on canonical pathway of NF-κB, phosphorylation of p65 subunit can be examined.   Although intracellular signaling pathways that play a role in IL-10 production from immune cells such as macrophages, dendritic cells or T cells have been characterized, intrinsic signal transduction pathways responsible for expression and secretion of IL-10 in Helicobacter-activated B cells have been ill-defined. It was recently reported that Helicobacter-activated IL-10+ B cells have important contribution to prevention of Helicobacter-associated gastric pathology. Identification of signaling pathways that take part in induction of IL-10 production from Helicobacter-activated IL-10+ B cells will pave the way for immune therapeutic researches that target these cells. For this reason, the focus of this study was identification of intracellular signaling pathways responsible for induction of IL-10 production from TLR2-stimulated B cells. For that purpose, splenic naïve B cells of C57BL/6 mice were stimulated with H.felis sonicate in order to induce IL-10 production and secretion. Then, H.felis sonicate-stimulated B cells were separated magnetically according to their IL-10 production capacities. Magnetic separation resulted in two fractions: Helicobacter-activated IL-10- B cells and IL-10+ B cells.  Protein samples of murine naïve B cells, Helicobacter felis sonicate-stimulated B cells, Helicobacter-activated IL-10- B cells and IL-10+ B cells were investigated for phosphorylation status of specific kinases which constitute significant junctions in MAPK, PI3K and NF-κB signaling pathways. Phosphorylation levels were determined via Western Blotting by making use of specific antibodies that recognize total- and phosphorylated forms of related signaling molecules. For investigation of NF-κB pathway, phosphorylation of p65 subunit was determined via signaling node sandwich ELISA method.  Following determination of phosphorylation status, the changes in IL-10 secretion from Helicobacter-activated B cells upon blocking of examined signaling pathways with specific inhibitors that inhibit activation of related kinases was investigated in order to identify the role of blocked signaling pathway on IL-10 production and secretion. For this purpose, p38 MAPK and ERK-1/2 modules of MAPK signaling pathway, PI3K signaling pathway and canonical pathway of NF-κB were blocked in murine naïve B cells and H.felis sonicate-stimulated B cells by chemical inhibitors. Then, the amount of secreted IL-10 culture supernatants was determined quantitatively by IL-10 ELISA.  The results of this study regarding identification of intracellular pathways taking part in induction of IL-10 production and secretion from Helicobacter-activated IL-10+ B cells revealed that ERK-1/2 got significantly more phosphorylated in Helicobacter-activated IL-10+ B cells following a comparison between Helicobacter-activated IL-10- B and IL-10+ B cells. On the other hand, phosphorylation levels of both p38 MAPK and Akt were found to be significantly elevated in Helicobacter-activated IL-10- B cells. No significant change in phosphorylation status of p65 subunit of NF-κB canonical signaling pathway was determined. These findings suggest a more prominent role for ERK-1/2 activation in induction of IL-10 production from Helicobacter-activated B cells. Moreover, investigation regarding the effect of blocked signaling pathways on IL-10 secretion showed that only inhibition of signal transduction through ERK-1/2 module of MAPK signaling pathway resulted in significant reduction of secreted IL-10 from Helicobacter-activated B cells. This finding supports the hypothesis on the prominent role of ERK-1/2 signaling in IL-10 production from Helicobacter-activated B cells. Significance of this research underlies in its contribution to the understanding of unexplored intrinsic signal transduction pathways of TLR2-mediated IL-10 production from B cells and the involvement of ERK-1/2 module of MAPK pathway in induction of IL-10 production from Helicobacter-activated B cells.Yüksek LisansM.Sc