Fortschritte bei der Vorhersage elektrischer Felder in Phytochromen: Ein Vibrational-Stark-Effekt-Ansatz zur Untersuchung der elektrischen Felddynamik von Agp2

Abstract

Phytochromes are photoreceptors that regulate a wide variety of physiological processes. Starting from the dark-adapted state, a light-induced trigger causes a reaction cascade that ultimately leads to the formation of the physiological active state. Depending on the type of phytochrome, the physiological active state can be either the Pfr (far-red-absorbing) state or the Pr (red-absorbing) state. However, the reaction mechanism following the light trigger through the intermediate states and how this very local effect propagates through the protein to the tongue region to trigger a secondary structure transition is still not understood. The main focus of this study was to understand the electric field effects present during the photoconversion process by exploiting the \ac{VSE}. The \ac{VSS} is a convenient tool to understand local electrostatics in proteins based on frequency shifts. The limitation being that the origin of these shifts has to be only electrostatic in nature. A severe limitation considering that one of the most important protein interactions includes hydrogen bonds. An alternative Stark approach uses the transition dipole moments instead of the frequency as observable to circumvent the hydrogen bonding effect, but its application on big systems like Agp2 is not trivial because of the difficulty in determining the concentration of the protein. The first part of the thesis investigates the importance of electrostatics in the photoconversion of the a bathy phytochrome Agp2 from \textit{Agrobacterium fabrum} on the basis of QM/MM models and experimental measurements. The second part focused on applying the linear Stark relationship to various mutant systems that incorporate a nitrile reporter group to validate and calibrate those models. The main body of this thesis comprises developing a strategy on how to handle this kind of system using a combination of theoretical and experimental methods to link spectroscopic observables with calculated properties of the Stark probe obtained by QM/MM and MD simulations. By employing this strategy, it was possible to predict the electric field using an internal standard even for states where no crystallographic data was available, while bypassing the necessity of a time-consuming concentration determinations. Furthermore, the electric field effect could be disentangled into a hydrogen-bond contribution and contributions based only on electrostatics. The resulting electric fields revealed that the noncovalent effects appear to be very local, neither confirming nor contradicting the hypothesis of propagating electric field trigger. However, the electric field values derived from this analysis that uses a sound theoretical model and also incorporates experimental observables are remarkably consistent with the structural environment shown by simulation and crystallography, providing a way to characterize the environment of the Stark label through electric fields even for large protein systems.Phytochrome sind Photorezeptoren, die eine Vielzahl von physiologischen Prozessen regulieren. Ausgehend vom dunkeladaptierten Zustand löst ein lichtinduzierter Auslöser eine Reaktionskaskade aus, die schließlich zur Bildung des physiologisch aktiven Zustands führt. Je nach Art des Phytochroms kann der physiologisch aktive Zustand entweder der Pfr (dunkelrot absorbierende) Zustand oder der Pr (rot absorbierende) Zustand sein. Der Reaktionsmechanismus, der auf die Lichteinstrahlung folgt und vor allem wie sich dieser sehr lokale Effekt durch das Protein bis hin zur tongue ausbreitet, um einen Sekundärstrukturübergang auszulösen, ist jedoch noch nicht verstanden. Das Hauptaugenmerk dieser Studie liegt auf dem Verständnis der elektrischen Feldeffekte während des Photokonversionsprozesses unter Ausnutzung des VSE. Der VSS ist ein geeignetes Instrument, um die Elektrostatik in Proteinen anhand von Frequenzverschiebungen zu untersuchen. Die Einschränkung ist, dass der Ursprung dieser Verschiebungen ausschließlich elektrostatischer Natur sein muss. Eine signifikante Einschränkung, wenn man bedenkt, dass zu den wichtigsten Proteinwechselwirkungen Wasserstoffbrücken gehören. Ein alternativer Ansatz des Stark Effekts verwendet die Übergangsdipolmomente anstelle der Frequenz als Beobachtungsgröße, um den Wasserstoffbrückenbindungseffekt zu umgehen, aber seine Anwendung auf große Systeme wie Agp2 ist nicht trivial, da es schwierig ist, die dafür notwendige Konzentration des Proteins zu bestimmen. Der erste Teil der Arbeit untersucht die Bedeutung der Elektrostatik bei der Photokonversion des Phytochroms Agp2 aus Agrobacterium fabrum auf der Grundlage von QM/MM-Modellen und experimentellen Messungen. Der zweite Teil konzentriert sich auf die Anwendung der linearen Stark Beziehung auf verschiedene mutierte Systeme, die eine Nitrilreportergruppe enthalten, mit dem Ziel diese Modelle zu validieren und zu kalibrieren. Der Hauptteil dieser Arbeit besteht aus der Entwicklung einer Strategie zur Behandlung dieser Art von Systemen unter Verwendung einer Kombination von theoretischen und experimentellen Methoden, um spektroskopische Beobachtungen mit berechneten Eigenschaften der Stark-Sonde zu verknüpfen, die durch QM/MM- und MD-Simulationen bestimmt wurden. Mit dieser Strategie war es möglich, das elektrische Feld unter Verwendung eines internen Standards auch für Zustände vorherzusagen, für die keine kristallographischen Daten verfügbar waren und dabei die Notwendigkeit einer zeitaufwändigen Konzentrationsbestimmung zu umgehen. Außerdem konnte der Effekt des elektrischen Feldes in einen Wasserstoffbrückenbindungsbeitrag und einen Beitrag, der nur auf der Elektrostatik beruht, aufgespalten werden. Die resultierenden elektrischen Felder zeigen, dass die nicht kovalenten Effekte sehr lokal zu sein scheinen, was die Hypothese der Ausbreitung des elektrischen Feldes weder bestätigt noch widerlegt. Die aus dieser Analyse abgeleiteten elektrischen Feldwerte, die ein solides theoretisches Modell verwendet und gleichzeitig experimentelle Beobachtungen einbeziehen, stimmen jedoch in bemerkenswerter Weise mit der strukturellen Umgebung überein, die durch Simulation und Kristallographie gezeigt worden ist und bieten eine Möglichkeit, selbst bei großen Proteinsystemen, die Umgebung der Stark-Sonde durch elektrische Felder zu charakterisieren.DFG, 221545957, SFB 1078: Protonation Dynamics in Protein FunctionDFG, 390540038, EXC 2008: UniSysCa