Development of a Golden Gate Assembly-Based Toolbox and Its Application for Engineering Lactiplantibacillus Plantarum as Monoterpenoid Producer

Abstract

Lactiplantibacillus plantarum (früher Lactobacillus plantarum) und andere Milchsäurebakterien werden aufgrund ihres allgemein als sicher anerkannten Status (GRAS) ausgiebig in der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Im Bereich der Getränkeproduktion spielt L. plantarum eine Schlüsselrolle bei der Fermentation von Sauerbier. Frühere Studien identifizierten Linalool und Geraniol, zwei in Hopfen vorkommende Monoterpenoide, als entscheidende Bestandteile des Bieraromas. Deswegen war es ein Ziel dieser Arbeit, die Produktion dieser beiden Stoffe in L. plantarum durch Stoffwechselmanipulation zu verbessern. Dies ermöglicht die Produktion eines aromatischeren und hopfenbetonteren Sauerbiers. Zum jetzigen Zeitpunkt ist der nicht Modellorganismus L. plantarum nur wenig erforscht und besitzt deswegen noch kein etabliertes genetisches System. Daher wurde in dieser Arbeit zunächst eine modulare und standardisierte Toolbox basierend auf dem Golden Gate Assembly erzeugt. Hierfür wurde die de novo-Assemblierung der Shuttle-Vektoren von E. coli für L. plantarum weiterentwickelt. Die Toolbox ermöglicht es Anwendern, genetische Elemente von Interesse, in einem Schritt, frei zu kombinieren und bis zu fünf Transkriptionseinheiten in einem Plasmid zu assemblieren. Eine Sammlung der relevantesten genetischen Bausteine, darunter verschiedene Replikationsursprünge, Fluoreszenzreporter sowie induzierbare und konstitutive Promotoren, wurden in unsere Toolbox integriert und genetisch standardisiert und charakterisiert. Die Expressionsvektoren zeigten eine vergleichbare Leistung wie die Benchmark-pSIP-Plasmide in diesem Forschungsbereich, boten jedoch eine höhere Flexibilität und Anpassungsfähigkeit. Im Hinblick auf die mikrobielle Monoterpenoidproduktion wurden mit dieser praktischen Toolbox mehrere pflanzliche Linalool- und Geraniolsynthasen sowie Schlüsselenzyme im vorgelagerten Biosyntheseweg untersucht. Darüber hinaus wurden Protein-Engineering von endogenen Enzymen von L. plantarum und die Optimierung der physiologischen pH-Bedingungen angewandt, um die Monoterpenoidproduktion zu steigern. Es wurden bis zu 1.535 µg L⁻¹ Linalool und 152 µg L⁻¹ Geraniol in L. plantarum produziert, wobei der Linalool-Titer deutlich über dessen Geruchsschwelle lag. Dies stellt auch den höchsten bisher in Milchsäurebakterien erzielten Monoterpenoid-Titer dar. Insgesamt wurde eine hocheffiziente und flexible Klonierungs-Toolbox für das zunehmend erforschte Milchsäurebakterium L. plantarum entwickelt. Sein Monoterpenoid-produzierender Stoffwechselweg wurde dahingehend manipuliert, dass eine fermentative Produktion von Aromazusätzen in diesem lebensmitteltauglichen Wirt möglich wurde. Zusammen mit den in dieser Studie evaluierten vielseitigen genetischen Bausteinen, trägt diese Forschung zur Erweiterung der genetischen Programmierbarkeit von L. plantarum und seines Potenzials als Probiotikum und als Biofabrik in der Pharmazie und Lebensmitteltechnik bei.Lactiplantibacillus plantarum (formerly Lactobacillus plantarum) and other lactic acid bacteria have been extensively utilized in the food industry due to their generally recognized as safe status. In the realm of beverage production, L. plantarum plays a key role in sour beer fermentation. Previous studies pinpointed linalool and geraniol, two monoterpenoids found in hops, as crucial contributors to beer flavor. Leveraging this knowledge, this work aimed at metabolically engineering L. plantarum to produce these two aroma compounds, paving the way for a more fragrant and hoppy sour beer. To date, scant knowledge and few genetic tools are available for the non-model microorganism L. plantarum. Therefore, this work first developed a modular and standardized Golden Gate Assembly-based toolbox for the de novo assembly of shuttle vectors from Escherichia coli to L. plantarum. The toolbox allows users to combine genetic elements of interest freely in a single step and assemble up to five transcriptional units within one plasmid. A collection of the most relevant genetic parts, including different origins of replication, fluorescence reporters, as well as inducible and constitutive promoters, were incorporated into our toolbox and characterized in a genetically standardized manner. The expression vectors displayed comparable performance with the benchmark pSIP plasmids in this research field, but provide higher flexibility and adaptability. Towards microbial monoterpenoid production, we screened several plant-derived linalool, geraniol synthases and key enzymes in the upstream biosynthesis pathway with this convenient toolbox. Further, protein engineering of L. plantarum endogenous enzymes and optimization of physiological pH conditions were also applied to boost monoterpenoid production. Up to 1,535 µg L-1 of linalool and 152 µg L-1 of geraniol were produced in L. plantarum with the linalool titer well above its odor threshold, which also represent the highest titer of aroma monoterpenoids ever achieved in lactic acid bacteria. Overall, a highly efficient and flexible cloning toolbox was developed for the increasingly studied lactic acid bacterium L. plantarum. Its monoterpenoid-producing pathway was manipulated towards a fermentative production of aroma additives in this food-grade host. Together with versatile genetic parts evaluated in this study, this research will contribute to expanding the genetic programmability of L. plantarum and its potential as a probiotic and biofactory for pharmaceutical and food applications