Subconjuntos funcionales de astrocitos en el núcleo accumbens

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 31-01-2025Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 31-07-2026To fully understand how information is processed in the brain, we need techniques able to specifically target and control the activity of those elements involved, including astrocytes. These cells are key elements of brain circuits involved in regulating different aspects of neuronal and synaptic physiology. However, they have been traditionally overshadowed by the emphasis on neuronal activity when regulating behavior, being relegated to supporting elements. Unlike neurons, organized into ensembles that encode different brain representations, astrocytes have long been considered a homogeneous population. Taking into account that recent research has started to evidence their rich heterogeneity, the main goal of this doctoral thesis is to understand to which extent astrocytes are functionally specialized into distinct subsets within the same brain region. To address this, nucleus accumbens (NAc) circuits have been dissected. The NAc is an important integrator center in which converge for instance different glutamatergic signals coming primarily from the medial prefrontal cortex (mPFC), basolateral amygdala (Amyg), and ventral hippocampus (vHipp). Using mice as experimental model, astrocytic calcium activity within the NAc has been studied by a combination of multidisciplinary experimental and analytical methods, including i) tool implementation to identify and manipulate functionally-specific astrocytes; ii) calcium imagining recordings in astrocytes, ex vivo in acute slices and in vivo with fiber photometry; iii) spatial analysis methods for mapping astrocytic activation; iv) patch-clamp electrophysiological recordings ex vivo and in vivo with custom probes; v) optogenetic manipulations of neurons; vi) selective expression of gain and loss of function actuators in astrocytes; vii) immunohistochemical analysis. The results include the implementation of two different tools to study astrocytic functional subsets within entire circuits. Using them, they demonstrate ex vivo the specialization of NAc astrocytes with respect to the main glutamatergic and dopaminergic inputs. Astrocytes respond in a pathway-specific manner and show non-linear calcium activity in response to the costimulation of simultaneous glutamatergic afferences. These integrative responses are not observed in the entire astrocytic population, but in a subset of functionally specific astrocytes, defined as astrocyte ensembles. Moreover, the existence in vivo of these ensembles was addressed, revealing the presence of behavior-related astrocyte ensembles in the context of a Pavlovian conditioning task. Gain and loss-of-function manipulations of the task ensemble demonstrate that this subset of astrocytes is necessary for tuning a specific cue-reward association related to NAc function. Our results show that this ensemble is related to such output only after a learning process, pointing to astrocytes as brain memory encoders of specific representations. In conclusion, this thesis presents novel tools for the functional study of astrocytes within specific circuits and behaviors, demonstrating that these cells do not act in homogeneous populations but that their activity is specialized into distinct astrocyte ensembles necessary for the functional outputs of the mouse nucleus accumbensPara entender en profundidad cómo el cerebro procesa información, necesitamos técnicas capaces de capturar y controlar específicamente la actividad de aquellos elementos involucrados, incluyendo a los astrocitos. Estas células son clave en los circuitos cerebrales regulando diversos aspectos de la fisiología sináptica y neuronal, sin embargo, han sido tradicionalmente relegados como células de soporte a la hora de estudiar cómo la actividad cerebral modula nuestro comportamiento. A diferencia de las neuronas, que se organizan en diferentes ensembles con los que el cerebro codifica representaciones específicas, los astrocitos se han considerado un grupo celular uniforme. Teniendo en cuenta que recientes investigaciones empiezan a dar evidencia de la rica heterogeneidad presente en estas células, el principal objetivo de esta tesis doctoral es entender hasta qué punto los astrocitos están funcionalmente especializados en subconjuntos dentro de una misma región cerebral. Para abordar esto, se han estudiado los circuitos del núcleo accumbens (NAc), un importante centro integrador en el que confluyen diferentes señales como las glutamatérgicas provenientes principalmente de la corteza prefrontal medial (mPFC), la amígdala basolateral (Amyg) y el hipocampo ventral (vHipp). Utilizando como modelo experimental el ratón, se ha estudiado la actividad de calcio en astrocitos del NAc mediante una combinación multidisciplinar de métodos experimentales y analíticos, incluyendo: i) la implementación de herramientas para identificar y manipular astrocitos funcionalmente específicos; ii) registros de imagen de calcio en astrocitos, tanto ex vivo utilizando cortes agudos como in vivo mediante fotometría de fibra óptica; iii) métodos de análisis espacial para mapear la activación de los astrocitos; iv) registros electrofisiológicos patch-clamp ex vivo e in vivo mediante implantes fabricados; v) manipulaciones optogenéticas de neuronas; vi) expresión selectiva de moléculas que permiten ganancia y pérdida de función en astrocitos; vii) análisis de inmunohistoquímica. Los resultados incluyen la implementación de dos herramientas distintas, diseñadas para discernir de entre toda la población subgrupos de astrocitos funcionalmente específicos. Mediante su uso se demuestra ex vivo que la actividad de calcio de los astrocitos del NAc está especializada con respecto a las principales vías de entrada glutamatérgicas y dopaminérgicas. En este contexto, se muestra que los astrocitos responden de manera específica a los estímulos provenientes de cada una de estas aferencias, adaptando sus respuestas de manera no lineal cuando la información proviene de la co-estimulación simultánea de distintas vías glutamatérgicas. Estos patrones integradores no se observan en el total de los astrocitos del accumbens, sino en subgrupos funcionales definidos como ensembles de astrocitos. La existencia de estos ensembles también se estudió in vivo, revelando la presencia de ensembles comportamiento-específicos en el contexto de una tarea Pavloviana. Experimentos de ganancia y pérdida de función demostraron que el subgrupo de astrocitos asociado a dicha tarea es necesario para modular una asociación estímulorecompensa específica y que está relacionada con la funcionalidad del NAc. Los resultados muestran que la función de este ensemble sólo se observa tras pasar por un proceso de aprendizaje, posicionando a los astrocitos como elementos de memoria capaces de codificar representaciones específicas dentro del cerebro. En conclusión, este trabajo presenta nuevas herramientas para el estudio funcional de los astrocitos con respecto a circuitos y comportamientos específicos, demostrando que estas células no actúan en poblaciones homogéneas, sino que su actividad está especializada en diferentes ensembles astrocíticos, necesarios para las funciones emergentes del núcleo accumbens del ratónThis work has been funded and supported by the Ramón y Cajal Program (RYC-2016-20414) and the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (RTI2018-094887-B-100 and PID2021- 122586NB-I00). Moreover, the PhD candidate has been awarded with an EMBO Scientific Exchange Grant and with the second prize of the dissemination contest “Yo Investigo. Yo soy CSIC” (CSIC) used to complete a 3 months’ internship at the laboratory of Prof. George Malliaras (University of Cambridge, United Kingdom