Modelización del mecanismo de priming de la PrimPol humana a partir de datos experimentales y estructuras predichas por la IA

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 24-01-2025Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 24-07-2026PrimPol is the second primase discovered in eukaryotic cells, whose main role in vivo is to rescue stalled replication forks during nuclear and mitochondrial DNA replication via repriming. Our current work is focused on deciphering the key structural elements involved in its unique DNA primase activity. Regarding the structure, PrimPol contains an archaeo-eukaryotic primase (AEP) catalityc domain followed by a Zn finger-containing domain (ZnFD). Since 2016, the crystal structure of the AEP core domain is available. However, the experimental structure of the ZnFD, which is essential for primase activity, remains unresolved. Using the artifical intellinge-based AlphaFold software, in this doctoral thesis we have modelled the conformation that PrimPol may adopt to initiate primer synthesis, in which both ZnFD (predicted) and AEP core (crystallized) domains are in a closed state and interact with the DNA template and with the first 2 substrate nucleotides. Thanks to this model, new key residues of the ZnFD implicated in template interaction and nucleotide binding have been identified. Moreover, previous work demonstrated that HsPrimPol is able to use translesion synthesis (TLS) abilities as a primase being able to skip DNA lesions during priming. Despite this, there was no evidence regarding whether the ZnFD of HsPrimPol is influencing in this particular TLS primase activity. In this doctoral thesis we prove that specific residues of the ZnFD, the 5’ triphosphate and the cryptic base are essential components in order to maintain HsPrimPol TLS primase activity. Our results indicate that just the lack of one of them is enough to completely disrupt the ability of HsPrimPol to skip lesions while priming. In addition, using the HsPrimPol ZnFD predicted structure we made a comparative structural analysis between accessory domains of other primases. As a result, we propose a structural model of the priming mechanism of PrimPol from Thermus thermophilus, an enzyme of interest in biotechnology. Moreover, a structural comparison between primases from different families has been performed and we show that Zinc finger domains of DnaG and AEP primases are structurally related. Finally, it has been reported that mitochondrial Polγ is blocked in vitro by the active form of the antiviral drug remdesivir (remdesivir triphosphate or RTP), but the low impact in vivo on mitochondrial DNA replication stalling is likely due to repriming by HsPrimPol, which also operates in mitochondria. In this doctoral thesis, we have tested if RTP is a valid substrate for both DNA primase and DNA polymerase activities of HsPrimPol, and its impact in the production of mature DNA primers. RTP has shown to be an invalid substrate for elongation, but it can be used to initiate primers at the 5·site, competing with ATP. Nevertheless, RTP-initiated primers are abortive, occasionally reaching a maximal length of 4-5 mer, and do not support elongation mediated by primer/template distortions. However, considering that the concentration of ATP, the natural substrate, is much higher than the intracellular concentration of RTP, it is unlikely that HsPrimPol would use RTP for primer synthesis during a remdesivir treatment in real patientsPrimPol es la segunda primasa descubierta en células eucariotas, cuya principal función in vivo consiste en rescatar mediante repriming las horquillas de replicación bloqueadas. El trabajo del laboratorio está enfocado en identificar los elementos estructurales clave implicados en su única actividad como DNA primasa. En relación a su estructura, PrimPol contiene un dominio catalítico arqueo-eucariota (AEP) seguido de un dominio de dedos de zinc o zinc finger (ZnFD). Desde 2016 se conoce la estructura cristalográfica del dominio AEP, pero la estructura del ZnFD, el cual es esencial para mantener la actividad primasa de la enzima, sigue sin estar determinada. En esta tesis doctoral, utilizando el software de inteligencia artifical Alphafold, se ha modelado la conformación que PrimPol adopará el comienzo del priming, en la cual ambos dominios (ZnFD y AEP) estarán en una conformación cerrada e interaccionando con el DNA molde y los dos primeros nucleótidos libres. Gracias a este modelo, se han identificado nuevos residuos del ZnFD implicados en la interacción con el template y el anclaje del nucleótido 5’. Además, trabajo previo demostró que HsPrimPol es capaz de realizar síntesis a través de lesiones (TLS) durante su actividad como primasa. A pesar de esto, no hay evidencia previa sobre si el ZnFD de HsPrimPol, el cual es esencial para mantener la actividad primasa, también es necesario para mantener la actividad de TLS primasa. En esta tesis doctoral se ha demostrado que tanto residuos específicos del ZnFD, como la presencia de un trifosfato en el nucleótido 5’, como la base críptica son componentes esenciales para mantener la actividad TLS primasa de HsPrimPol. Nuestros resultados indican que basta con perder uno de ellos para perder completamente la actividad TLS de HsPrimPol durante el primado. Por otro lado, comparamos la predicción estructural del ZnFD de HsPrimPol con los dominios accesorios de otras primasas. Como resultado pudimos hacer un modelo estructural y del mecanismo de primado de la PrimPol de Thermus thermophilus, una enzima con interés biotecnológico. Asimismo, la comparación estructural entre primasas de diferentes familias nos ha permitido demostrar que la estructura de los ZnFDs de las primasas de las familias DnaG y AEP están emparentadas. Por último, se publicó que la Polγ mitocnodiral es bloqueada in vitro por la forma activa de la droga antiviral remdesivir (remdesivir trifosfato o RTP). Sin embargo, el poco impacto que se observó en el genoma mitocondrial in vivo sugiere que HsPrimPol puede estar actuando. En esta tesis doctoral hemos ensayado si el RTP es un sustrato válido tanto para la actividad DNA polimerasa como la actividad DNA primasa de la PrimPol humana y su impacto en la producción de primers maduros. El RTP resultó ser un sustrato no válido para elongación, pero pudo ser usado por la enzima para iniciar primers, compitiendo con el ATP por el extremo 5·del primer. A pesar de esto, los primers iniciados con RTP fueron abortivos y nunca pasaron de 4-5 nucleótidos. Si se considera que la concentración intracelular del ATP es muy superior a las del RTP, es muy improbable que HsPrimPol pueda usar RTP para hacer primers durante un tratamiento con remdesivir en la clínicaThis doctoral thesis has been fnanced through the Spanish Government (Ref.PGC2018-093576-B-C21(FEDER),Programa Estatal de Generación de Conocimiento;and Ref.PRE2019-08784