Regulación funcional de la expresión génica por Especies Reactivas de Oxígeno mediante la oxidación directa de 5mC a 5hmC

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de Lectura: 12-11-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 12-05-2026La metilación del ADN es un mecanismo epigenético fundamental para el mantenimiento de patrones de expresión génica específicos, tanto durante el desarrollo embrionario como en tejidos adultos, que está asociada con la compactación de la cromatina y la represión de la transcripción génica. La adición de grupos metilo en la posición 5' de la citosina (5mC) en dinucleótidos CpG, catalizada por la familia de proteínas ADN metiltransferasa (DNMT), puede ser estable a largo plazo y transmitirse a través de las divisiones celulares, pero no es una modificación química irreversible y puede revertirse de forma dinámica. La familia de proteínas Ten-eleven translocation (TET) cataliza la oxidación de 5mC para generar 5-hidroximetilcitosina (5hmC) a través de procesos redox, promoviendo de esta forma la desmetilación del ADN por vías pasivas y activas, e induciendo la distensión de la cromatina y la activación transcripcional. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se generan durante la reducción del oxígeno molecular para formar agua. En organismos eucariotas, las ROS se producen mayoritariamente como productos secundarios residuales del metabolismo aerobio. No obstante, existen también mecanismos enzimáticos específicos, como ciclooxigenasas, lipoxigenasas o NADPH oxidasas (NOX), capaces de generar pequeñas cantidades de ROS en respuesta a señales específicas. En este sentido, la producción de ROS en sistemas biológicos es un proceso hormético: su producción por encima de un umbral crítico genera daño celular, mientras que por debajo de este umbral puede funcionar como un mecanismo señalizador. Así la producción continuada de altos niveles de ROS genera estrés oxidativo y daño celular irreversible por la oxidación directa de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Por el contrario, la producción dedicada de bajos niveles de ROS tiene una función señalizadora implicada en la regulación de procesos celulares clave como proliferación, diferenciación, adhesión o motilidad. En este trabajo se propone la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión génica basado en la producción fisiológica de niveles no letales de ROS capaces de oxidar de forma directa 5mC para formar 5hmC. Los resultados obtenidos mostraron, en primer lugar, que la activación de una producción transitoria de ROS mediante un procedimiento fotodinámico en soluciones acuosas conteniendo moléculas desnudas de ADN, en ausencia de proteínas, lípidos o hidratos de carbono, promueve efectivamente la oxidación de 5mC a 5hmC. Posteriormente, se adaptó este procedimiento fotodinámico para inducir de forma local y transitoria la producción de ROS in vivo en células en cultivo (fibroblastos de piel) y tejidos (piel) murinos. Los resultados obtenidos en ambos modelos mostraron que la activación de la producción transitoria de niveles fisiológicos de ROS induce la oxidación de 5mC a 5hmC a nivel genómico global, sin alterar los niveles de expresión o la actividad de las proteínas TET. Los resultados obtenidos también mostraron que esta activación transitoria de niveles fisiológicos de ROS induce cambios definidos en los patrones de expresión génica, asociados en genes diana y reporteros, a cambios en el patrón de metilación de islas CpG (CGIs) en regiones promotoras y de su actividad transcripcional. Por último, con objeto de identificar un posible mecanismo fisiológico subyacente, se implementó un modelo celular basado en NOX4, la única proteína de esta familia localizada en el núcleo, para promover una producción nuclear de ROS independientemente del procedimiento fotodinámico. Para ello se utilizaron fibroblastos de ratón deficientes en el gen que codifica para NOX4 (Nox4 -/-). Los resultados obtenidos mostraron que la estimulación de la expresión y actividad de NOX4 por Angiotensina II (AII), promueve una acumulación de niveles no letales de ROS en el núcleo y la oxidación de 5mC a 5hmC, asociada a una inducción de la proliferación celular. En conjunto, estos resultados demuestran que una producción local de ROS en el compartimento nuclear efectivamente promueve la oxidación de 5mC a 5hmC, modulando los patrones de metilación del ADN y la actividad transcripcional de genes diana. De este modo las ROS podrían actuar como biorreguladores directos de la expresión génica. La caracterización detallada de los mecanismos moleculares implicados permitirá diseccionar en profundidad las distintas capacidades señalizadores de las ROS, potenciando el desarrollo de nuevas terapias epigenéticas para el tratamiento de enfermedades como el cánce