Ekstrakcija kolagena iz meduza: optimizacija metode

Abstract

Jellyfish are a novel source for collagen extraction, and it is derived from multiple Medusozoa species, including Rhizostoma pulmo. Their collagen is evolutionary older and simpler than mammalian collagens making them compatible with human biology. Its specific response to macrophages - a lower M1 macrophage response and a higher M2 macrophage response - triggers regeneration in tissue, making jellyfish collagen a candidate biomaterial for tissue engineering. To compare the collagen composition, multiple sequence alignment was performed between different types of human collagen and between murine collagen using SALIGN. Sequence alignment of fibrillar collagens showed similarities in characteristic glycine and proline regions, and in lysine sites in the sequence. Amino acid analysis showed several differences in composition between different collagen sources. The extraction of collagen from jellyfish consists of three main steps: sample preparation, extraction, and recovery, and can last up to 7 days. This lengthy procedure can lead to collagen degradation and a decrease in final yield. Current methods consist of tissue cutting and chemical pretreatment during sample preparation, acid and enzymatic extraction, and dialysis. The goal of this research was to see how changes in the extraction steps affect collagen yield, purity, and the methods duration. For this purpose, samples from Rhizostoma pulmo were first lyophilized, followed by acid extraction with 0,5 M acetic acid, salting out with NaCl, and purification with C18 cartridges. The obtained collagen powder was analyzed using MALDI-TOF-MS to confirm the successful extraction of collagen. In addition, FTIR and SDS-PAGE were performed to further confirm the presence of collagen. The collagen yields that were obtained are similar to those recorded in previous studies. Based on these results, it can be concluded that the use of C18 cartridges can be an alternative for dialysis and could shorten the extraction process.Meduze su nov izvor kolagena, a kolagen se dobiva iz nekoliko vrsta Medusozoa, uključujući Rhizostoma pulmo. Kolagen iz meduza je evolucijski stariji i jednostavniji od kolagena sisavaca, što ga čini kompatibilnim s ljudskom biologijom. Njegov specifičan odgovor na makrofage - niži odgovor M1 makrofaga i viši odgovor M2 makrofaga - potiče regeneraciju tkiva, što čini kolagen meduza potencijalnim biomaterijalom u tkivnom inženjerstvu. Da bi se usporedio sastav kolagena, višestruko poravnanje sekvenci (multiple sequence alignment) je izvršeno između različitih tipova ljudskog kolagena i između mišjeg kolagena koristeći SALIGN. Poravnanje sekvenci fibrilarnih kolagena pokazalo je sličnosti u karakterističnim glicinskim i prolinskim regijama te u mjestima na kojima su lizini u sekvencama. Analiza aminokiselina pokazala je nekoliko razlika u sastavu između različitih izvora kolagena. Ekstrakcija kolagena iz meduza sastoji se od tri glavna koraka: pripreme uzorka, ekstrakcije i oporavka, i može trajati do 7 dana. Ovaj dugotrajan postupak može dovesti do degradacije kolagena i smanjenja konačnog prinosa. Trenutne metode uključuju usitnjavanje tkiva i kemijsko tretiranje tokom pripreme uzorka, kiselinsku i enzimsku ekstrakciju, kao i dijalizu. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi kako promjene u koracima ekstrakcije utiču na prinos, čistoću kolagena i trajanje metode. U tu svrhu, uzorci vrste Rhizostoma pulmo su prvo liofilizirani, nakon čega je uslijedila ekstrakcija kiselinom koristeći 0,5 M octenu kiselinu, isoljavanje pomoću NaCl i pročišćavanje uz pomoć C18 kolona. Dobiveni kolagen je analiziran pomoću MALDI-a kako bi se potvrdila uspješna ekstrakcija kolagena. Također, FTIR i SDS-PAGE su odrađeni radi dodatne potvrde prisustva kolagena u izolatu. Prinosi kolagena koji su dobiveni slični su onima zabilježenim u prethodnim studijama. Na osnovu ovih rezultata, može se zaključiti da upotreba C18 kolona može biti alternativa za dijalizu i mogla bi skratiti proces ekstrakcije