Optimisation of coagulation factor IX purification from human plasma

Tradicionalne metode proizvodnje terapeutskih proteina često u upstream procesu uključuju uzgoj staničnih linija, sakupljanje stanica, staničnu lizu, precipitaciju proteina, filtraciju i druge korake. U downstream procesima, procesima pročišćavanja terapeutskih proteina, koristi se kromatografija. Ključan korak optimizacije procesa čišćenja terapeutskih proteina iz kompleksnih smjesa, bila bi implementacija kromatografskih nosača na koje se mogu direktno primjeniti uzorci kompleksnih karakteristika, bez potrebe za dodatnom obradom i/ili predrazrijeđivanjem uzorka. U ovom radu to je demonstrirano na primjeru pročišćavanja koagulacijskog faktora IX IZ nerazrijeđene ljudske plazme sa odstranjenim krioprecipitatom. U tradicionalnom postupku čiščenja faktora IX, uzorak plazme se razrjeđuje, nakon čega slijede dva koraka kromatografije ionske izmjene. Kao posljednji korak koristi se afinitetna kromatografija na nosaču sa heparinskim ligandom životinjskog porijekla. Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je na monolitne polimetakrilatne kromatografske nosače moguće direktno nanositi kompleksne biološke uzorke, a da pritom ne dolazi do neželjenih biokemijskih i biofizikalnih promjena ljudske plazme. To svojstvo monolitnih polimetarkrilatnih nosača iskorišteno je za pročišćavanje koagulacijskog faktora IX direktno iz plazme sa odstranjenim krioprecipitatom na DEAE kationskim izmjenjivačima. Također, utvrđeno je da se kao alternativa kromatografskim nosačima sa imobiliziranim heparinskim ligandom, u daljnjem pročišćavanju faktora IX mogu upotrijebiti kromatografski nosači sa kovalentno vezanim sulfatnim skupinama. Implementacija prethodna dva koraka predstavlja osnovu za novi (semi)kontinuirani proces proizvodnje u svrhu čišćenja i izolacije terapijskog pripravka koagulacijskog faktora IX.Traditional methods used in the upstream production of therapeutic proteins often include cell lines, cell harvesting and lysis, protein precipitation, filtration, and other steps. Chromatography is usually used in the downstream processes. A key step towards optimizing the process of therapeutic proteins purification from complex mixtures, would be the implementation of chromatographic supports to which samples with complex characteristics can be directly applied, without the need for additional processing and/or pre-dilution of the sample. Using the example of undiluted human plasma, it was demonstrated that it is possible to directly apply complex biological materials to monolithic polymethacrylate chromatographic supports, without unwanted biochemical and biophysical changes in the biological material. This property of monolithic polymethacrylate supports was used to purify coagulation factor IX directly from plasma with cryoprecipitate removed. In the traditional purification process of factor IX, the last step is affinity chromatography on a support with a heparin ligand of animal origin. In our experiments, it was established that as an alternative to chromatographic carriers with immobilized heparin ligand, chromatographic carriers with covalently bound sulfate groups can be used. The implementation of the previous two steps represents the basis for a new (semi)continuous production process for the purpose of cleaning and isolating the therapeutic preparation of coagulation factor IX

Stabilnost galij-dopamin nanočestica u različitim vodenim medijima

Antibiotic resistance is slowly becoming a serious problem in global public health due to antibiotic overuse, and due to a significant rise in multi-drug resistant bacteria. A lot of research has been put into finding antibacterial alternatives. Metal ions and metal-based nanoparticles are currently being studied as an alternative to antibiotics. Among various metals with antibacterial properties, gallium (Ga) ions and their nanoparticles have attracted attention due to their antibacterial properties. However, due to the low bioavailability of gallium ions, and the unique physicochemical properties of nanoparticles, gallium nanoparticles (Ga NPs) might be a better alternative compared to ions. Factors that can influence the antibacterial efficiency of Ga NPs are yet to be researched. In this work, the change in concentration of Ga NPs and their dissolution at different temperatures (20 °C and 37 °C) was measured in various aqueous media: distilled water, phosphate saline buffer (PBS), and bacterial growth medium (Mueller Hinton Broth, MHB). Determination of gallium ions concentration and Ga NPs was performed by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Dissolution and ICP-MS ion release profiles of Ga NPs in different aqueous solutions and at different temperatures were observed and compared. Results suggest that the rates of dissolution differ in all of the investigated solutions and that temperature affects dissolution. Ga NPs at lower temperatures are more stable in all three solutions and have fewer statistical deviations. At higher temperatures, dissolutions went over 100 % in PBS and MHB. Even though Ga NPs are very stable in distilled H2O, distilled water has low dissolution rates, which might not be ideal for the antibacterial purpose of Ga NPs. Dissolution of Ga NPs is consistent, slowly increasing over 24 hours, at 20 °C. Around 80 % dissolution is detected in PBS and almost 100 % in MHB after 24 h, at lower temperatures. The effects of aqueous media on Ga NPs dissolution demonstrate that both PBS and MHB enable favorable dissolution, especially at 20 °C.Otpornost na antibiotike polako postaje ozbiljan problem u svjetskom javnom zdravstvu zbog prekomjerne uporabe antibiotika i značajnog porasta bakterija koje su otporne na više vrsta lijekova. Puno je istraživanja uloženo u pronalaženje antibakterijskih alternativa. Metalni ioni i nanočestice bazirane na metalima trenutno se proučavaju kao alternativa antibioticima. Među raznim metalima s antibakterijskim svojstvima, ioni galija (Ga) i njegove nanočestice privukli su pozornost zbog antibakterijskih svojstava. Međutim, zbog niske bioraspoloživosti iona galija i jedinstvenih fizikalno-kemijskih svojstava nanočestica, nanočestice galija (engl. gallium nanoparticles, Ga NP) mogle bi biti bolja alternativa nego ioni. Čimbenici koji mogu utjecati na antibakterijsku učinkovitost Ga NP tek treba istražiti. U ovom radu, promjena koncentracije Ga NP i njihovo otapanje na različitim temperaturama (20 °C i 37 °C) mjerit će se u različitim vodenim medijima: destilirana voda, fosfatni pufer i medij za rast bakterija (Mueller Hinton Broth, MHB). Određivanje koncentracije galijevih iona i Ga NPs provedeno je pomoću spektrometrije masa uz induktivno spregnutu plazmu (ICP-MS). Promatrani su i uspoređeni profili otapanja nanočestica i otpuštanja Ga iona u različitim vodenim otopinama i na različitim temperaturama. Rezultati pokazuju da se otapanja Ga NP razlikuju u svim ispitivanim otopinama, te da temperatura utječe na otapanje. Ga NP na nižim temperaturama stabilnije su u sve tri otopine i rezultati imaju manja statistička odstupanja. Pri višim temperaturama dobivene su vrijednosti otapanja preko 100 % u PBS i MHB. Iako su Ga NP vrlo stabilne u destiliranoj H2O, destilirana voda ima niske stope otapanja, što možda nije idealno za antibakterijsku svrhu Ga NP. Otapanje Ga NP je dosljedno, polako se povećava tijekom vremenskog raspona od 24 sata, na 20 °C. Oko 80 % otapanja detektirano je u PBS-u i gotovo 100 % u MHB-u nakon 24 sata, na nižoj temperaturi. Učinci vodenih medija na otapanje Ga NP pokazuju da i PBS i MHB omogućuju povoljno otapanje nanočestica, posebno na 20 °C

Zbirka zadataka iz analitičke kemije

Zbirka zadataka iz analitičke kemije pripremljena je u skladu s nastavnim programom kolegija „Analitička kemija“ koji se izvodi na Fakultetu biotehnologije i razvoja lijekova Sveučilišta u Rijeci. Namijenjena je studentima (studenticama) prve godine preddiplomskog studija Biotehnologija i istraživanje lijekova i drugih srodnih studija. Sadržaj Zbirke zadataka prilagođen je izvođenju auditornih vježbi seminarske nastave u okviru nastavnog programa kolegija. Zbirka sadrži teorijski dio, riješene zadatke i zadatke za vježbu s rješenjima. Zadaci u Zbirci, podijeljeni u šest poglavlja, prikupljeni su i odabrani iz međunarodno provjerenih izvora i osobne arhive s ciljem veće uspješnosti studenata u rješavanju zadataka auditornih vježbi

Interakcija optineurina i TDP-43 u staničnim modelima amiotrofične lateralne skleroze

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is neurodegenerative disease caused by mutations in more than 30 different genes, which act by different and often still unclear pathogenic mechanisms. Two major features mark all ALS cases: insoluble protein aggregates in neurons and glia, and neuroinflammation. Aggregates in the majority of ALS cases, regardless of genetic cause, comprise TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), an RNA/DNA-binding protein with functions in splicing, mRNA metabolism and miRNA production. In contrast, OPTN gene is a rare cause of ALS. It encodes a multifunctional adaptor protein optineurin (Optn) proposed to regulate many cellular processes like autophagy, inflammation, Golgi maintenance and vesicular trafficking. Recent data from our laboratory have shown that both Optn insufficiency and deficiency caused an increase in endogenous TDP-43 levels in myeloid cells (microglia and macrophages), which was unexpectedly not caused by an autophagy block. Inflammatory stimulation by a lipopolysaccharide (LPS), which was previously shown to stimulate TDP-43 aggregation, elevated TDP-43 levels in WT but could not increase already elevated TDP-43 levels in cells lacking functional optineurin. Notably, no aggregates were formed in neither WT nor optineurin insufficient or deficient cells. Here generated a new mouse model carrying transgenic TDP-43G348C and truncated Optn470T/470T to test if transgenic TDP-43 causes greater proteotoxic stress than endogenous TDP-43 and leads to signs of ALS pathology in vitro or in vivo. We investigated transgenic TDP-43 levels in bone marrow-derived macrophages (BMDM) and observed higher TDP-43 levels in Optn470T/470T/TDP-43G348C compared to WT/TDP-43G348C BMDM. Transgenic TDP-43 thus did accumulate in Optn insufficient cells, but not because of an autophagy block. Also, we observed that transgenic TDP-43 levels cannot be additionally increased upon LPS stimulation in Optn470T/470T/TDP-43G348C BMDM, in contrast to WT cells. Notably, transgenic TDP-43 was not cytotoxic in unmanipulated BMDM but caused apoptosis after LPS stimulation in both optineurin sufficient and insufficient cells. Immunofluorescent analysis showed that transgenic TDP-43 was not depleted from the nucleus and did not aggregate upon LPS stimulation in BMDM. In addition, we investigated spinal cords of transgenic mice model and observed no signs of ALS pathology (neuronal loss and TDP-43 aggregation) in neither WT nor Optn470T/470T 8-month-old mice. In conclusion, in this study, we showed that transgenic TDP-43 has elevated protein levels in Optn insufficient BMDM, just like it was previously shown for endogenous TDP-43, but this is not caused by an autophagy block and does not result in cytotoxicity. Moreover, optineurin insufficiency did not precipitate the pathology in TDP-43G348C mouse model, at least not at the early stage of disease. Further studies are necessary to investigate pathology in Optn470T/470T/TDP-43G348C model at later stages.Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je neurodegenerativna bolest koju uzrokuju mutacije u više od 30 gena, koji djeluju prema različitim, i još uvijek nejasnim, patogenim mehanizmima. Dva glavna obilježja označavaju sve slučajeve ALS-a: netopljivi proteinski agregati, u neuronima i glija stanicama, i neuroinflamacija. Agregati u većini ALS slučajeva, neovisno o genetskom uzroku, sadrže TAR DNA-vezujući protein 43 (TDP-43), RNA/DNA-vezujući protein čije su funkcije prekrajanje, metabolizam RNA i miRNA. Suprotno tome, OPTN gen je rijedak uzrok ALS-a. Gen kodira multifunkcionalni adaptor protein optineurin (Optn), za koji se smatra da regulira mnoge stanične procese poput autofagije, upale, održavanja Golgija i vezikularnog transporta. Nedavni rezultati iz našeg laboratorija pokazali su da insuficijencija i deficijencija Optn uzrokuju povećanje razina endogenog TDP-43 u mijeloidnim stanicama (mikrogliji i makrofagima), koje, neočekivano, nije uzrokovano blokadom autofagije. Stimulacija upale sa lipopolisaharidom (LPS), koja je ranije pokazala da stimulira agregaciju TDP-43, povećala je razine TDP-43 u WT, ali nije uspjela povećati već povećane razine TDP-43 u stanicama bez funkcionalnog Optn. Značajno, agregati nisu formirani niti u WT niti u Optn insuficijentnim ili deficijentnim stanicama. U ovom radu proizveli smo novi mišji model sa transgeničnim TDP-43G348C i skraćenim Optn470T/470T kako bismo istražili uzrokuje li transgenični TDP-43 veći proteotoksični stres od endogenog TDP-43 i dovodi li do znakova patologije ALS-a in vitro ili in vivo. Testirali smo razine transgeničnog TDP-43 u makrofagima dobivenim iz koštane srži (BMDM) i uočili smo veće razine TDP-43 u Optn470T/470T/TDP-43G348C nego u WT/TDP-43G348C BMDM. Transgenični TDP-43 se nakupljao zbog insuficijencije Optn, a ne blokade autofagije. Također, uočili smo da se razine transgeničnog TDP-43 ne mogu dodatno povisiti stimulacijom LPS-om u Optn470T/470T/TDP-43G348C BMDM, za razliku od WT stanica. Transgenični TDP-43 nije bio citotoksičan u netretiranim stanicama, ali je uzrokovao apoptozu nakon stimulacije LPS-om u stanicama oba genotipa. Imunofluorescentna analiza nije pokazala nuklearnu depleciju niti agregaciju transgeničnog TDP-43 nakon stimulacije LPS-om u BMDM. Pored toga, testirali smo leđne moždine transgeničnog mišjeg modela i nismo uočili patološke znakove ALS-a (gubitak neurona i TDP-43 agregati) niti u WT niti Optn470T/470T miševima starim 8 mjeseci. Zaključno, u ovom radu pokazali smo da transgenični TDP-43 ima povećane razine proteina u Optn insuficijentnim BMDM, kao što je to prethodno prikazano za endogeni TDP-43, ali to nije uzrokovano blokadom autofagije i nije rezultiralo citotoksičnošću. Štoviše, Optn insuficijencija nije ubrzala patologiju TDP-43G348C mišjeg modela, barem ne u ranom stadiju bolesti. Dodatna istraživanja su potrebna kako bi se istražila patologija u Optn470T/470T/TDP-43G348C modelu u kasnijim stadijima

Agregacija, paralelna agregacija i koagregacija proteina u kroničnim mentalnim bolestima

Chronic mental illnesses (CMIs), including schizophrenia (SZ), bipolar disorder (BiPD), and major depressive disorder (MDD), present a substantial burden on individuals and healthcare systems worldwide. CMIs exhibit complex etiologies involving a mixture of genetic and environmental factors. While protein aggregation is a well-established hallmark of neurodegenerative diseases, its role in CMIs remains poorly understood. Key questions remain unanswered, such as whether aggregation occurs uniformly across brain regions, whether different proteins aggregate within the same individuals, what drives this aggregation, and how it may contribute to behavioral symptoms. This thesis aims to address these knowledge gaps by investigating the causes and effects of protein aggregation in CMIs, with a focus on the potential for co-aggregation of key candidate proteins. This research utilizes post-mortem human brain samples, in vitro cell models, and a transgenic Drosophila model. Analysis of human brain samples revealed distinct patterns of insolubility and aggregation for CRMP1, DISC1, NPAS3, and TRIOBP-1 across different brain regions linked to SZ, MDD, and suicide. Notably, these proteins were found to co-aggregate within the same individuals, including some healthy controls, suggesting either shared physiological mechanisms or differential pathological thresholds. The extent and location of aggregation varied between brain regions and individuals, showing that it does not follow a consistent pattern based on diagnosis. Moreover, the link between protein aggregation, genetic mutation, and environmental susceptibility was investigated using wild-type and mutant forms of NPAS3 in cell culture experiments. While previous research showed that mutation alone can cause NPAS3 aggregation, my findings demonstrated that loss of nuclear localization and potential aggregation can also occur under physiological and stress conditions, even in the absence of mutation. This suggests that these changes may be less dependent on genetic alterations than previously assumed. Region-specific analysis further revealed that the PAS1 domain strongly influences NPAS3 localization in cells, promoting its retention in the cytoplasm rather than the nucleus. This mislocalization may reduce NPAS3's functional activity and increase its susceptibility to aggregation. Additionally, CRMP1 showed potential for co-aggregation with DISC1 and TRIOBP-1 in cells, echoing findings from human brain analyses. Additionally, the Drosophila model expressing human DISC1 variants shows potential for revealing behavioral and molecular alterations. However, the model requires thorough validation due to lack of expression control. These findings establish that protein aggregation in CMIs is a heterogeneous, region-dependent process, with multiple proteins aggregating within the same individuals. It also provides new evidence that co-aggregation may be a contributing molecular mechanism in CMIs. Moreover, it highlights how both genetic and environmental stressors can influence aggregation. This study is limited by variability in brain tissue quality, protein aggregation detected in controls, and reliance on overexpression models in cell culture. Also, the Drosophila model showed leaky gene expression and requires further validation. Taken together, these factors highlight the need for improved models and normalization methods in future research. Nevertheless, the results from this thesis lay the groundwork for future research into protein aggregation as a potential biomarker or therapeutic target, offering novel molecular insights into the pathophysiology of CMIs.Kronične mentalne bolesti (KMB), uključujući shizofreniju (SZ), bipolarni poremećaj (BiPD) i kliničku depresiju (KD), predstavljaju značajan teret za pojedince i zdravstvene sustave diljem svijeta. KMB imaju složenu etiologiju koja uključuje kombinaciju genetskih i okolišnih čimbenika. Iako je agregacija proteina dobro poznata značajka neurodegenerativnih bolesti, njezina uloga u KMB još uvijek nije dovoljno istražena. Ključna pitanja ostaju neodgovorena: događa li se agregacija ravnomjerno u različitim regijama mozga, agregiraju li različiti proteini unutar istih pojedinaca, što pokreće agregaciju i kako ona može pridonijeti razvoju simptoma. Ova disertacija ima za cilj popuniti te praznine u znanju istraživanjem uzroka i posljedica agregacije proteina u KMB, s posebnim naglaskom na mogućnost koagregacije ključnih kandidata proteina. Opisano istraživanje uključuje analize post-mortem uzoraka ljudskog mozga, in vitro stanične modele i transgenični model vinske mušice (Drosophila). Analiza ljudskog moždanog tkiva otkrila je različite obrasce netopljivosti i agregacije proteina CRMP1, DISC1, NPAS3 i TRIOBP-1 u različitim regijama mozga povezanim sa SZ, MDD i suicidalnim ponašanjem. Analizirani proteini koagregirali unutar određenih pojedinaca sa dijagnozom i u kontrolnim uzorcima, upućujući na zajedničke fiziološke mehanizme ili različite patološke pragove. Opseg i lokalizacija agregacije varirali su među regijama mozga i pojedincima te agregacija nije bila dosljedna ni specifična za dijagnozu. Nadalje, povezanost agregacije proteina, genetskih mutacija i osjetljivosti na okoliš istražena je pomoću divljeg i mutiranog oblika proteina NPAS3 u staničnim kulturama. Iako su prethodna istraživanja pokazala kako sama mutacija može uzrokovati agregaciju NPAS3, moji rezultati pokazuju kako gubitak nuklearne lokalizacije i potencijalna agregacija mogu nastupiti i pod fiziološkim i stresnim uvjetima, čak i bez mutacije. Stoga opisane promjene mogu biti manje ovisne o genetici nego što se prethodno mislilo. Analiza regija proteina NPAS3 dodatno je pokazala kako PAS1 domena snažno utječe na lokalizaciju NPAS3 u stanicama, potičući njegovu lokalizaciju u citoplazmi umjesto u jezgri. Opisana promjena u lokalizaciji može smanjiti funkcionalnu aktivnost NPAS3 i povećati njegovu sklonost agregaciji. Također, pokazala sam kako CRMP1 može koagregirati s DISC1 i TRIOBP-1 u stanicama, što je u skladu s rezultatima analize uzoraka ljudskog mozga. Transgenični model vinske mušice koji eksprimira ljudski DISC1 pokazuje potencijal za otkrivanje bihevioralnih i molekularnih promjena, ali zahtijeva detaljnu validaciju zbog nedostatka kontrole ekspresije. Opisani rezultati potvrđuju heterogenost i specifičnost agregacija proteina u KMB, pri čemu više proteina može agregirati unutar istih pojedinaca. Disertacija također nudi nove dokaze kako koagregacija može biti molekularni mehanizam koji doprinosi razvoju KMB te ističe utjecaj genetskih i okolišnih čimbenika na agregaciju. Ovo istraživanje ima ograničenja, uključujući varijabilnost kvalitete tkiva, agregaciju proteina kod kontrola te prekomjernu ekspresiju proteina u staničnim kulturama. Također, Drosophila model pokazuje manjak kontrole ekspresije proteina, zbog čega zahtijeva dodatnu validaciju. Sveukupno, korišteni modeli i metode zahtjevaju značajnu modifikaciju u budućim istraživanjima. Unatoč tome, rezultati ovog rada postavljaju temelje za daljnja istraživanja agregacije proteina kao potencijalnog biomarkera ili terapijskog cilja, nudeći nove molekularne uvide u patofiziologiju KMB

The latest drugs in the treatment of oncological diseases

Onkološke bolesti čine veliki zdravstveni problem u svijetu, a rak je među vodećim uzrocima smrti u mnogim zemljama. Kada je u pitanju liječenje raka, poznato je da je proces liječenja jako složen i dugotrajan. Pristupi liječenju kao što su kemoterapija i radioterapija imaju mnogo nedostataka. Srećom, u posljednjih nekoliko godina postignut je velik i značajan napredak na području onkologije. Ovaj napredak uključuje razvoj imunoterapije i ciljane terapije kao potencijalno najboljih mogućnosti za liječenje različitih vrsta raka. Kada se radi o imunoterapiji, najboljima su se pokazali "checkpoint" inhibitori te adoptivna T-stanična terapija, konkretnije CAR T-stanična terapija. Među odobrenim lijekovima za liječenje raka u posljednjih nekoliko godina najviše su zastupljeni upravo lijekovi koji pripadaju nekoj od vrsta imunoterapije. Među najnovijima iz 2024. godine su primjerice tislelizumab i lifileucel. Druga vrsta inovativne terapije, ciljana terapija, također se pokazala vrlo uspješnom. Ova terapija uključuje razne inhibitore tirozin kinaze i monoklonska protutijela od kojih su se obećavajućima pokazala bispecifična protutijela. Najnovije odobrena bispecifična protutijela iz 2023. godine su elranatamab i talquetamab. Ciljana terapija je veliko otkriće iz razloga što ciljano djeluje na specifični antigen na stanicama raka, ne oštećujući previše zdrave ljudske stanice. Naravno, u tijeku je razvoj i mnogih drugih novih pristupa za liječenje raka. Veliki broj terapija još se uvijek nalazi u fazi kliničkih ispitivanja, a u sljedećih par godina mogao bi biti odobren značajan broj novih lijekova.Cancer constitutes a major health problem worldwide and is among the leading causes of death in many countries. When it comes to cancer treatment, it is well known that the process is highly complex and takes time. Traditional approaches such as chemotherapy and radiotherapy have not proven to be the best options. Fortunately, significant progress has been made in the field of oncology in recent years. This progress includes the development of immunotherapy and targeted therapy as potentially the best options for treating various types of cancer. In the realm of immunotherapy, checkpoint inhibitors and adoptive cell therapy, specifically CAR T-cell therapy, have shown the most promise. Among the approved cancer treatments in the past few years, the majority belong to some form of immunotherapy. Notable examples from 2024 include tislelizumab and lifileucel. Another type of innovative therapy, targeted therapy, has also proven to be very successful. This therapy includes various tyrosine kinase inhibitors and monoclonal antibodies, among which bispecific antibodies have shown great promise. The newest approved bispecific antibodies from 2023 are elranatamab and talquetamab. Targeted therapy is a significant breakthrough because it specifically targets antigens on cancer cells, causing minimal damage to healthy human cells. Naturally, the development of many other new approaches to cancer treatment is ongoing. A large number of therapies are still in clinical trial phases, and a significant number of new drugs could be approved in the next few years

The latest achievements in cellular immunotherapy

Zbog toga što rak predstavlja jedan od vodećih uzroka smrti u svijetu, intenzivno se radi na otkriću novih vrsta terapije. Upravo imunoterapija predstavlja nov i moderan pristup u liječenju raka, zaraznih bolesti i autoimunih bolesti. Obećavajuće rezultate pokazuje osobito u liječenju malignih formacija. Za razliku od tradicionalni terapija (kemoterapija i radioterapija), ona direktnim djelovanjem na imunosni sustav postiže efikasnu reakciju i odgovor na tumore, što je čini sigurnijom i manje štetnom za pacijente. Dijeli se na nekoliko značajnih područja, staničnu imunoterapiju, imunoterapiju antitijelima, checkpoint inhibitore, citokinsku terapiju, imunomodulatore i cjepiva. Zbog svojih iznimnih rezultata u kliničkim ispitivanjima pa i činjenice da je već nekoliko terapija odobreno od strane FDA, odlučio sam više pažnje posvetiti upravo staničnoj imunoterapiji, a posebice CAR-T stanicama. Stanična imunoterapija doživjela je veliki procvat te čini temelj za budućnost liječenja raka. Ona se bazira na poboljšanju funkcija imunosnih stanica njihovom modifikacijom, multiplikacijom i aktivacijom, a dijeli se prema vrsti stanice čije se funkcija poboljšava. Razlikujemo adoptivnu T staničnu (TILs, CAR-T, TCR-T), NK staničnu, CIK staničnu imunoterapiju i DC cjepiva. Najznačajnija vrsta terapije, upravo je adoptivna T stanična imunoterapija. Pokazuje iznimno dobre rezultate u liječenju raka, a zbog intenzivnog i predanog istraživanja u ovom području rada, već je odobren niz terapija ove vrste.Because cancer is one of the leading causes of death worldwide, intensive efforts are being made to discover new types of therapy. Immunotherapy represents a new and modern approach in the treatment of cancer, infectious diseases, and autoimmune diseases. It shows promising results especially in the treatment of malignant formations. Unlike traditional therapies (chemotherapy and radiotherapy), it achieves an effective reaction and response to tumors by directly acting on the immune system, making it safer and less harmful to patients. It is divided into several significant areas: cellular immunotherapy, antibody immunotherapy, checkpoint inhibitors, cytokine therapy, immunomodulators, and vaccines. Due to its remarkable results in clinical trials and the fact that several therapies have already been approved by the FDA, I have decided to focus more on cellular immunotherapy, especially on CAR-T cells. Cellular immunotherapy has experienced a significant breakthrough and forms the foundation for the future cancer treatments. It is based on enhancing the functions of immune cells through their modification, multiplication, and activation, and it is categorized based on the type of cell whose function is being improved. We distinguish between adoptive T cell (TILs, CAR-T, TCR-T), NK cell, CIK cell immunotherapy, and DC vaccines. The most significant type of therapy is adoptive T cell immunotherapy. It shows exceptionally good results in cancer treatment, and due to intensive and dedicated work, a series of therapies of this kind have already been approved

Beta-oksidacija u modelu kvasca Barthovog sindroma

Barth syndrome is a complicated and life-threatening systemic disease. It is characterized by a wide range of conditions, mostly affecting the heart and skeletal muscles. Symptoms include cardiomyopathy, skeletal myopathy, neutropenia, increased urinary excretion of 3-methylglutaconic acid and weaker motor skills. Being a genetic disease, it is currently uncurable and is managed through medications that decrease symptom severity. The syndrome is caused by mutations in the TAZ gene which encodes the tafazzin enzyme. Tafazzin has an important role in the cardiolipin synthesis and remodeling pathway. Cardiolipin is a unique phospholipid that makes up a significant portion of the inner mitochondrial membrane. It goes through a complex and highly conserved synthesis and remodeling pathway which is altered in patients with Barth syndrome. Unlike other phospholipids, cardiolipin has a specific structure that differs from other phospholipids and enables it to interact with various membrane proteins and complexes, playing a crucial role in maintaining mitochondrial energy metabolism. By gaining a deeper understanding of the molecular mechanisms and the significance of cardiolipin synthesis and remodeling, new treatment strategies could be developed. These strategies would target the underlying cause of the disease, unlike currently available therapeutic approaches. One potential target is beta-oxidation. Trimetazidine, a drug commonly used to treat heart conditions, inhibits beta-oxidation and has been shown in previous studies to affect mitochondrial phospholipid turnover. However, its impact on cardiolipin synthesis and turnover remains unknown. In this research, we are interested in investigating if inhibition of beta-oxidation enhances mitochondrial phospholipid turnover and increases the levels of functional cardiolipin in cells with TAZ deficiencies. Saccharomyces cerevisiae serves as an excellent model organism for studying Barth syndrome because all the enzymatic steps involved in cardiolipin synthesis and remodeling are conserved between yeast and humans.Barthov sindrom je složena, po život opasna bolest koja zahvaća cijeli organizam. Karakteriziran je širokim spektrom simptoma, koji uglavnom zahvaćaju srce i tjelesne mišiće. Simptomi uključuju kardiomiopatiju, skeletnu miopatiju, neutropeniju, povećano izlučivanje 3-metilglutakonske kiseline putem urina te slabije motoričke sposobnosti. Kao genetska bolest je neizlječiva, a pacijenti se tretiraju lijekovima koji ublažavaju prisutne simptome. Bolest je uzrokovana mutacijama u TAZ genu koji kodira enzim tafazzin. Tafazzin ima važnu ulogu u sintezi i remodeliranju kardolipina. Kardolipin je specifičan fosfolipid koji čini značajan udio unutarnje membrane mitohondrija. Prilikom sinteze i remodeliranja, kardiolipin prolazi složen i evolucijski očuvan put koji je izmijenjen kod pacijenata s Barthovim sindromom. Za razliku od većine fosfolipida, kardolipin ima specifičnu strukturu koja mu omogućuje interakciju s raznim proteinskim kompleksima u mitohondriju. Ovo svojstvo omogućava ključnu ulogu kardiolipina u održavanju mitohondrijskog energetskog metabolizma. Boljim razumjevnjem značaja i molekularnog mehanizma sinteze kardiolipina, mogle bi se razviti nove strategije u liječenju Barthovog sindroma. Jedna potencijalna strategija je inhibicija beta-oksidacije. Trimetazidin, lijek koji se koristi za liječenje srčanih oboljenja, inhibira beta-oksidaciju te prema prethodnim istraživanjima, utječe na promjenu sastava mitohondrijskih fosfolipida. Međutim, utjecaj trimetazidina na kardiolipin je nepoznat. U ovom istraživanju nastojimo ispitati može li inhibicija beta-oksidacije povećati promjenu mitohondrijskih fosfolipida i povećati razine funkcionalnog kardolipina u stanicama s TAZ mutacijama. Saccharomyces cerevisiae je izvrstan modelni organizam za proučavanje Barthovog sindroma jer su svi enzimski koraci uključeni u sintezu i remodeliranje kardolipina evolucijski očuvani između kvasca i ljudi

Characterization of CO releasing metallosurfractant aggregates intended for biomedical applications

Od početka istraživanja terapeutskih sposobnosti CO, postojala je potreba za ciljanom dostavom ove terapije. Zbog toga, razvili su se razni kemijski spojevi koji otpuštaju CO. Među njima su izuzetni metalni karbonili , zbog velikog kapaciteta prijenosa CO. Mijenjajući ligande vezane za metal u koordinacijskom centru, poboljšala se permeabilnost u biološkim sustavima. Ovi karakterizirani spojevi, koji mogu imati metalni dio u polarnom ili hidrofobnom dijelu molekule, nazivaju se metalosurfraktanti. Zbog povećane amfifilnosti, grade razne supramolekularne agregate u vodenim sredinama. U prijašnjim istraživanjima, metalosurfraktant sa molibdenom je pokazao miješivost sa fosfatidilkolinom u agregate poznate kao metalosomi- sa fizikalno-kemijskim svojstvima, zbog kojih su prikladniji za primjenu u biološkim sustavima, u odnosu na agregate od čistih metalosurfraktanta. Glavni cilj ovog projekta, bio je opisati interakciju metalosoma, koji sadrže metalosurfraktant PCOL10, sa stanicama. Sekundarni cilj, bio je razvijanje metodologije za istraživanje svojstva metalosurfraktanta i metalosoma sa alatima računalne kemije. Nakon razvitka metodologije za proizvodnju PCOL10 metalosoma sa kontroliranim veličinama metalosoma, opisana su fizička i kemijska svojstva pod uvijetima relevantnima za inkubaciju sa stanicama. Zatim, stanične kulture ljudskih fibroblasta su inkubirane s metalosomima, te potom analizirane s microFTIR spektroskopijom u Alba sinkrotronu. Na temelju toga, opisana je ovisnost internalizacije metalosoma u stanicama, u odnosu na trajanje inkubacije, koncentraciju metalosoma i njihovu veličinu. Eksperimenti inkubacije u stanicama, pokazali su kako je internalizacija PCOL10 metalosoma u stanicama, uglavnom ovisna o vremenu inkubacije i koncentraciji. Laboratorijski dio rada obavljen je na Autonomnom Sveučilištu u Barceloni, u laboratoriju Lipidno-baziranih sustava dostave lijekova.Since the start of research into the therapeutic abilities of CO, systems for targeted delivery and release have been needed. Because of this, the category of CO releasing molecules includes numerous types of compounds. Among them, metal-carbonyl compounds are distinguished because of their high CO carrying capacity. These compounds were further optimized to improve specific targeting, by modifying the groups connected to the metal. The results, were compounds that can either include the metal into the polar, or hydrophobic group, called metallosurfractants. Their improved amphiphilic character, allows them to form supramolecular structures in an aqueous medium. In previous research, a molybdenum based metallosurfractant has shown miscibility with phosphatidylcholine that forms vesicles known as metallosomes, with improved physicochemical properties compared to pure metallosurfractant aggregates. The principal aim of this project was characterizing the interaction of PCOL10-metallosomes with cells. The secondary aim was to develop a workflow that models the properties of metallosurfactants and metallosomes, using computational chemistry. First, after developing a reproducible method for preparing PCOL10 metallosomes, the physical and chemical properties under conditions relevant for cell incubations were described. Finally, the metallosomes were incubated in cultures of human fibroblasts and analyzed using microFTIR spectroscopy at Alba synchrotron. The dependence of cell internalization upon incubation time, metallosome size and concentration, was described. The cell incubation studies showed that cell internalization of PCOL10 metallosomes depends mainly on incubation time and concentration. All laboratory research was carried out at the Autonomous University of Barcelona, at the Lipid-based drug delivery systems laboratory