Aplicació de l'enzim piruvat descarboxilasa en un sistema multienzimàtic de captura i conversió del co2 per a la síntesi d'àcid làctic i en un sistema multienzimàtic per a la síntesi d'acetoïna com a producte bio-basat

Abstract

La biocatàlisi és una tecnologia que permet la biotransformació de substrats a productes de forma sostenible i respectuosa amb el medi ambient. Aquest fet és reconegut per la conformitat en 10 dels 12 principis de la química verda, que busca la implantació de processos sostenibles i menys contaminants. En la present tesi doctoral s'utilitza un enzim anomenat piruvat descarboxilasa, aprofitant la peculiaritat d'aquest enzim de catalitzar tant una reacció de carboxilació com una reacció de carbolligació, per al desenvolupament de dos sistemes multienzimàtics: Un sistema multienzimàtic com a tecnologia CCU per a la síntesi d'àcid làctic a partir de CO2, mitjançant una carboxilació catalitzada per la PDC i ii) un sistema multienzimàtic per a la síntesi d'un compost bio-basat, l'acetoïna, a partir d'etanol mitjançant una carbolligació catalitzada per la PDC. En la primera part de la tesi es duu a terme la producció dels enzims necessaris per als estudis de les reaccions (alcohol deshidrogenasa de S. cerevisiae (ScADH), piruvat descarboxilasa de S. cerevisiae (ScPDC) i lactat deshidrogenasa de T. maritima (TmLDH)) a través d'un cultiu fed-batch assolint altes densitats cel·lulars. Posteriorment, es duu a terme la purificació dels enzims piruvat descarboxilasa de Z. palmae (ZpPDC), ScADH, ScPDC, TmLDH i NADH oxidasa de S. pyogenes (SpNOX), aplicant millores al procés de purificació per cromatografia d'afinitat o d'intercanvi aniònic per tal d'incrementar el rendiment de purificació. La liofilització dels enzims s'aconsegueix amb un rendiment suficient per satisfer les necessitats d'enzims, i la qual permet l'emmagatzematge a llarg termini dels biocatalitzadors. En la segona part d'aquesta tesi, es desenvolupa el sistema multienzimàtic com a estratègia de captura i conversió del CO2 (CCU) per a la síntesi d'àcid làctic a partir de CO2 i etanol en el marc del projecte europeu BIOCON-CO2. Aquest sistema, el qual incorpora un sistema intern de regeneració del cofactor, està format pels enzims alcohol deshidrogenasa, piruvat descarboxilasa i lactat deshidrogenasa, en el qual la PDC catalitza la carboxilació de l'acetaldehid a àcid pirúvic. Aquest sistema presenta una limitació important en el pas de carboxilació, de tal manera que s'estudien diferents estratègies des de l'optimització de les quantitats i proporcions dels enzims, fins a l'enginyeria del medi de reacció, aconseguint obtenir 250 [Mu]M d'àcid làctic, la concentració més alta obtinguda per aquest sistema fins al moment. I, per primera vegada, també es posa a prova el sistema utilitzant un gas sintètic que imita la composició d'un gas de sortida dels alts forns de la indústria metal·lúrgica, assolint una concentració d'àcid làctic de 69 [Mu]M. La immobilització dels enzims en diferents suports indica que el millor suport és la Ni2+-IDA-agarosa, amb el qual es duu a terme la reacció en cicles, obtenint un rendiment similar a quan s'utilitzen els enzims solubles. En la tercera part d'aquesta tesi es desenvolupa el segon sistema multienzimàtic plantejat com a estratègia de síntesi d'un producte bio-basat, l'acetoïna, a partir d'etanol. En aquest cas el sistema consta d'alcohol deshidrogenasa, piruvat descarboxilasa i NADH oxidasa, on la PDC catalitza la reacció de carbolligació de dues molècules d'acetaldehid. A més, la NADH oxidasa permet la regeneració del cofactor. Els estudis de les reaccions involucrades permeten determinar les millors condicions de reacció, mitjançant l'ajust en les proporcions dels enzims, i determinant que la purificació dels enzims és essencial per evitar reaccions secundàries que provoquen el consum del intermedis de reacció, aconseguint la conversió completa (100%) a partir de 50 mM d'etanol en les millors condicions estudiades. Finalment, s'aconsegueix millorar l'eficiència de la regeneració del cofactor mitjançant l'ajust de la concentració de cofactor, millorant el nombre de recanvi de 5 a 38 mols de producte per mol de cofactor.La biocatálisis es una tecnología que permite la biotransformación sostenible de sustratos en productos. Este hecho es reconocido por la conformidad con 10 de los 12 principios de la química verde, que busca la implementación de procesos sostenibles y menos contaminantes. En la presente tesis doctoral se utiliza una enzima llamada piruvato descarboxilasa, aprovechando la peculiaridad de esta enzima para catalizar tanto una reacción de carboxilación como una reacción de carboligación, para el desarrollo de dos sistemas multienzimáticos: i) un sistema multienzimático como tecnología CCU para la síntesis de ácido láctico a partir de CO2, mediante una carboxilación catalizada por la PDC, y ii) un sistema multienzimático para la síntesis de un compuesto bio-basado, la acetoína, a partir de etanol mediante una carboligación catalizada por la PDC. En la primera parte de la tesis se lleva a cabo la producción de las enzimas necesarias para los estudios de las reacciones (alcohol deshidrogenasa de S. cerevisiae (ScADH), piruvato descarboxilasa de S. cerevisiae (ScPDC) y lactato deshidrogenasa de T. maritima (TmLDH)) a través de un cultivo fed-batch logrando altas densidades celulares. Posteriormente, se realiza la purificación de las enzimas piruvato descarboxilasa de Z. palmae (ZpPDC), ScADH, ScPDC, TmLDH y NADH oxidasa de S. pyogenes (SpNOX), aplicando mejoras al proceso de purificación para aumentar el rendimiento de purificación. La liofilización de las enzimas se logra con un rendimiento suficiente para satisfacer las necesidades de enzimas, lo que permite el almacenamiento a largo plazo de los biocatalizadores. En la segunda parte de esta tesis, se desarrolla el sistema multienzimático como estrategia de captura y conversión del CO2 (CCU) para la síntesis de ácido láctico a partir de CO2 y etanol en el marco del proyecto europeo BIOCON-CO2. Este sistema, que incorpora una regeneración interna de cofactor, está formado por las enzimas alcohol deshidrogenasa, piruvato descarboxilasa y lactato deshidrogenasa, en el cual la PDC cataliza la carboxilación del acetaldehído a ácido pirúvico. Este sistema presenta una limitación en el paso de carboxilación, por lo que se estudian diferentes estrategias desde la optimización de las cantidades y proporciones de enzimas hasta la ingeniería del medio de reacción, logrando obtener 250 [Mu]M de ácido láctico, la concentración más alta obtenida por este sistema hasta el momento. Y, por primera vez, se pone a prueba el sistema utilizando un gas sintético que imita la composición de un gas de salida de los altos hornos de la industria metalúrgica, logrando una concentración de ácido láctico de 69 [Mu]M. La inmovilización de las enzimas en diferentes soportes indica que el mejor soporte es la Ni2+-IDA-agarosa, con el cual se lleva a cabo la reacción en ciclos, obteniendo un rendimiento similar al de los enzimas solubles. En la tercera parte de esta tesis se desarrolla el segundo sistema multienzimático planteado como estrategia de síntesis de un producto bio-basado, la acetoína, a partir de etanol. En este caso, el sistema consta de alcohol deshidrogenasa, piruvato descarboxilasa y NADH oxidasa, donde la PDC cataliza la reacción de carboligación de dos moléculas de acetaldehído. Además, la NADH oxidasa permite la regeneración del cofactor. Los estudios de las reacciones involucradas permiten determinar las mejores condiciones de reacción, mediante el ajuste en las proporciones de los enzimas, y determinando que la purificación de los enzimas evita las reacciones secundarias que provocan el consumo de los intermediarios de reacción, logrando la conversión completa (100%) a partir de 50 mM de etanol en las mejores condiciones estudiadas. Finalmente, se mejora la eficiencia de la regeneración del cofactor mediante el ajuste de su concentración, mejorando el número de recambio de 5 a 38 moles de producto por mol de cofactor.Biocatalysis is a technology that allows the biotransformation of substrates into products in a sustainable and environmentally friendly manner. This fact is recognized by the compliance with 10 out of the 12 principles of green chemistry, which aims to the implementation of sustainable and less contaminating processes. In this doctoral thesis, an enzyme called pyruvate decarboxylase is used, taking advantage of its ability to catalyze both carboxylation and carboligation reactions, for the development of two multienzymatic systems: i) a multienzymatic system as a Carbon Capture and Utilization (CCU) technology for the synthesis of lactic acid from CO2, through PDC-catalyzed carboxylation, and ii) a multienzymatic system for the synthesis of a bio-based compound, acetoin, from ethanol through PDC-catalyzed carboligation. In the first part of the thesis, the production of the necessary enzymes for the reaction studies (S. cerevisiae alcohol dehydrogenase (ScADH), S. cerevisiae pyruvate decarboxylase (ScPDC), and T. maritima lactate dehydrogenase (TmLDH)) is carried out through a fed-batch culture achieving high cell densities. Then, the purification of enzymes such as Z. palmae pyruvate decarboxylase (ZpPDC), ScADH, ScPDC, TmLDH, and S. pyogenes NADH oxidase (SpNOX) is performed, applying improvements to the purification process through affinity or anion exchange chromatography to increase purification yield. Enzyme lyophilization is achieved with sufficient yield to meet enzyme requirements, allowing long-term storage of the biocatalysts. In the second part of this thesis, a multienzymatic system is developed as a Carbon Capture and Utilization (CCU) strategy for the synthesis of lactic acid from CO2 and ethanol within the framework of the European project BIOCON-CO2. This system, which incorporates an internal cofactor regeneration system, consists of alcohol dehydrogenase, pyruvate decarboxylase, and lactate dehydrogenase, where PDC catalyzes the carboxylation of acetaldehyde to pyruvic acid. This system has a significant limitation in the carboxylation step, so various strategies are studied, from optimizing enzyme quantities and proportions to reaction media engineering, achieving a concentration of 250 [Mu]M lactic acid, the highest concentration obtained by this system to date. For the first time, the system is also tested using a synthetic gas that mimics the composition of an off-gas from iron&steel industry blast furnaces, achieving a lactic acid concentration of 69 [Mu]M. Enzyme immobilization on different supports indicates that Ni2+-IDA-agarose is the best support, and the reaction is carried out in cycles, achieving a similar yield to when soluble enzymes are used. In the third part of this thesis, the second multienzymatic system is developed as a strategy for the synthesis of a bio-based product, acetoin, from ethanol. In this case, the system consists of alcohol dehydrogenase, pyruvate decarboxylase, and NADH oxidase, where PDC catalyzes the carboligation reaction of two acetaldehyde molecules. Additionally, NADH oxidase allows cofactor regeneration. Studies of the involved reactions helped to determine the best reaction conditions through enzyme proportions adjustments. It is found that enzyme purification is essential to avoid secondary reactions that consume reaction intermediates, achieving complete conversion (100%) from 50 mM ethanol under the best studied conditions. Finally, the cofactor regeneration efficiency is improved by adjusting the cofactor concentration, increasing the turnover from 5 to 38 moles of product per mole of cofactor