Προσδιορισμός του ρόλου του παν-νευροτροφικού υποδοχέα p75 στην ενήλικη νευρογένεση του ιπποκάμπου, ως νέα θεραπευτική προσέγγιση στη νόσο Αλζχάιμερ

Abstract

The pan-neurotrophin p75 receptor (p75NTR) is a member of the TNF death receptor superfamily, being widely expressed in many cell types among the neural tissue, including adult neural stem cells (aNSCs). Its remarkable up-regulation during neurodegeneration and its controversial signaling, ranging from survival to cell death, have attracted a special interest on this receptor as a potential pharmacological target. The association between p75NTR and Alzheimer’s Disease (AD) is of great interest in general, as p75NTR is highly expressed in degenerative populations in the development of AD pathology. p75NTR has been also extensively linked with AD by serving as a receptor for Amyloid-beta (Aβ), the major component of the plaques, found in the brain of AD patients. Furthermore, recent revolutionary studies are highlighting the importance of this receptor on the adult hippocampal neurogenesis, but contradictory results and lack of explicit methodology rather confuse the field, than defining the role of the receptor. Our study ranges from in vivo detection of adult neurogenesis in combined p75KO and AD mouse models to in vitro cell cultures. We reveal that the p75NTR is important to neurogenesis and the fate of aNSCs and we also explore the role of p75NTR in neurogenesis under the neuropathology of AD, as well. More specifically, this study focuses on the effects of p75NTR in adult neurogenesis of the dentate gyrus (DG) of rodent hippocampus, under physiological and neurodegenerative conditions, such as AD, as well as on examination of receptor's activity related to cell death or survival. By revealing and controlling the specific signaling pathways necessary to mediate the actions of p75NTR on stem cells, we could target the endogenous ability of neurogenesis. In the first part of our study, we evaluated the in vivo adult hippocampal neurogenesis in p75 knockout mice, compared to wildtype (2 months old and 6 months old mice). Our study was based on the evaluation of two different mouse models of p75 gene deletion. The first one, is the p75 ko Ngfrtm1Jae targeted mutation 1 -developed by Dr Rudolf Jaenisch and named p75NTR/ExonIII-, which lacks the full-length receptor. The second one is a conditional knock out which has a specific deletion of exon II in Nestin expressing cells based on the recombination of a p75NTRflox mouse with the Nestin/Cre mouse. Our results from the first mouse model are showing a significantly decreased number of proliferative aNSCs in p75 ko mice of 2 months old. These results are pointing out the necessity of p75NTR on adult neurogenesis. In a second step, we examined the effects of receptor’s deletion on the differentiation of aNSCs, using Dcx and NeuN markers and we gained results suggesting that immature neurons cannot proceed and differentiate into mature neurons. In parallel, we examined the mice with the specific p75 exonII deletion on Nestin+ cells. This mouse line provides significant evidence for the role of p75 in neurogenesis by defining the cell autonomous signaling pathways that are controlling stem cell fate. Finally, in order to investigate the role of p75NTR in a mouse model of Alzheimer’s Disease, we have crossed p75 ko exonIII with the 5xFAD mouse, an amyloid beta dependent mouse model of AD. In this mouse line, we also identify neurogenesis levels compared to wild-type as well. Additionally, we explore p75-dependent effects on human iPSCs-derived NPCs, in order to validate the results of the existing animal models but also to explore the effects of this neurotrophin receptor in human neurons, since these kind of studies are very rare till now, underlying the novelty of our work. Study of p75NTR involvement in human neurogenesis includes various research questions. Firstly, the expression and activity of p75NTR as well as its downstream mediators are identified. Moreover, we investigate p75NTR’s effects in human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)-derived NPCs, depicting receptor’s signaling and its dysregulation in NPCs derived from AD patients bearing the ApoE4 mutation. Furthermore, we study the role of the receptor in combination with the toxic effects of oligomerized Amyloid-beta, showing how p75NTR regulates hiPSCs-derived NPCs in the presence of Aβ amyloid, indicating its involvement in both AD progress and neurogenesis. These results provide useful information regarding the role of p75NTR in NPCs maintenance and its putative therapeutic role.In a pharmacological approach of our studies, we tested a chemical library of novel synthetic neurotrophin analogs in order to decipher the signaling properties of the receptor. These synthetic analogs are derived from dehydroepiandrosterone (DHEA), a previously shown activator of the receptor, and they were designed with preferable pharmacological properties that could selectively activate p75NTR and specific pathways that originate from this receptor. Despite the beneficial effects of neurotrophins on brain function, their therapeutic use is compromised due to their polypeptidic nature and blood–brain-barrier impermeability. To overcome these limitations, our previous studies have proven that small-sized, lipophilic, DHEA-derived synthetic analogs can exert neurotrophic effects, as they bind to specific neurotrophin receptors and thus they could be used as neurotrophin mimetics with favorable pharmacological properties. The present study also revealed the biological characterization of a newly synthesized analog, ENT-A044, and its role in inducing cell-specific functions of p75NTR. Treatment of cells with this compound showed a significant increase at cell death and pJNK expression, mediated by p75NTR in human iPSCs-derived NPCs as opposed to primary cell cultures derived from mice, where ENT-A044 led to survival. Thus, Neurotrophin Analog ENT-A044 Activates the p75 Neurotrophin Receptor, Regulating Neuronal Survival in a Cell Context-Dependent Manner. In conclusion, ENT-A044 is proposed as a lead molecule for the development of novel pharmacological agents, providing new therapeutic approaches and research tools, by controlling p75NTR actions. All the aforementioned studies offer valuable tools for selective control of p75NTR in AD, through the specific regulation of its endogenous neurogenic potential, as a novel repairing mechanism against neurodegeneration. In addition, adult neurogenesis consists a scientific field that has recently attracted special interest, although with many anticipating findings and strong arguments. The discovery of adult neurogenic potential in the brain opens new avenues and opportunities for treating neurological diseases, particularly through the exploitation of endogenous regenerative capacity. The detailed mapping of single cell properties and functions, based on the tempo-spatial expression of multifunctional regulatory receptors such as p75NTR, could provide an advantage for controlling neurogenesis and the related cognitive functions.Ο παν-νευροτροφικός υποδοχέας p75 (p75NTR) είναι μέλος της υπερ-οικογένειας των υποδοχέων θανάτου Tumor Necrosis Factor (TNF) που εκφράζεται ευρέως σε πολλούς τύπους κυττάρων του νευρικού ιστού, συμπεριλαμβανομένων των ενήλικων νευρικών βλαστικών κυττάρων (aNSCs). Η αξιοσημείωτη αύξηση της κυτταρικής του έκφρασης κατά τη διάρκεια της νευροεκφύλισης και η πολύπλοκη σηματοδότησή του, που κυμαίνεται από την επιβίωση έως τον κυτταρικό θάνατο, έχουν προσελκύσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τον υποδοχέα αυτό, ως πιθανό φαρμακολογικό στόχο. Η συσχέτιση μεταξύ του p75NTR και της Νόσου Αλτσχάιμερ (ΝΑ) παρουσιάζει ιδιαίτερα μεγάλο ενδιαφέρον, καθώς ο p75NTR εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε πληθυσμούς αποπτωτικών νευρικών κυττάρων κατά την εξέλιξη της παθολογίας της ΝΑ. Ο p75NTR έχει επίσης συνδεθεί εκτενώς με τη ΝΑ, καθώς χρησιμεύει ως υποδοχέας για το αμυλοειδές-β (Aβ), το κύριο συστατικό των αμυλοειδικών πλακών, που βρίσκονται στον εγκέφαλο των ασθενών με ΝΑ. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες αναδεικνύουν τη σημασία αυτού του υποδοχέα στην ενήλικη νευρογένεση του ιπποκάμπου, αλλά τα αντιφατικά αποτελέσματα και η έλλειψη σαφούς μεθοδολογίας δεν αποσαφηνίζουν το ρόλο του υποδοχέα. Η παρούσα μελέτη εκτείνεται από την in vivo ανίχνευση της ενήλικης νευρογένεσης σε διασταυρούμενα μοντέλα ποντικών με έλλειψη του υποδοχέα (p75 knock out) και ζωϊκά μοντέλα της NA, έως την μελέτη του υποδοχέα σε in vitro πρωτογενείς καλλιέργειες νευρικών κυττάρων. Η μελέτη μας καταδεικνύει ότι ο p75NTR είναι σημαντικός για τη νευρογένεση και την τύχη των ενήλικων βλαστικών κυττάρων (aNSCs) και διερευνούμε τον ρόλο του p75NTR στη νευρογένεση υπό τη νευροπαθολογία της ΝΑ. Πιο συγκεκριμένα, η παρούσα μελέτη επικεντρώνεται στον έλεγχο των δράσεων του p75NTR στην ενήλικη νευρογένεση της οδοντωτής έλικας (DG) του ιπποκάμπου των τρωκτικών, υπό φυσιολογικές και νευροεκφυλιστικές συνθήκες, όπως η ΝΑ, καθώς και στην εξέταση της κυτταρικής δράσης του υποδοχέα που σχετίζεται με τον κυτταρικό θάνατο ή την επιβίωση. Αποκαλύπτοντας και ελέγχοντας τα συγκεκριμένα σηματοδοτικά μονοπάτια που είναι απαραίτητα για τη διαμεσολάβηση των δράσεων του p75NTR στα βλαστικά κύτταρα, θα μπορούσαμε να στοχεύσουμε την ενδογενή ικανότητα της νευρογένεσης ως μια καινοτόμο θεραπευτική προσέγγιση. Στο πρώτο μέρος της μελέτης μας αξιολογήσαμε την in vivo ενήλικη νευρογένεση του ιππόκαμπου σε ποντίκια p75 knockout, σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου (ποντίκια ηλικίας 2 και 6 μηνών). Η μελέτη μας εξαρτάται από την αξιολόγηση δύο διαφορετικών μοντέλων ποντικών με διαγραφή του γονιδίου p75. Το πρώτο, είναι το p75 ko Ngfrtm1Jae στοχευμένης μετάλλαξης 1 -το οποίο αναπτύχθηκε από τον Δρ. Rudolf Jaenisch κι ονομάστηκε p75NTR/ExonIII-, και το οποίο στερείται του υποδοχέα πλήρους μήκους. Το δεύτερο, προέκυψε από την διασταύρωση p75flox ζώων με ζώα που έχουν μια ειδική διαγραφή του εξονίου ΙΙ σε κύτταρα που εκφράζουν νεστίνη (Nestin Cre), με βάση τη χρήση του συστήματος ρεκομπινάσης. Τα αποτελέσματά μας από το πρώτο μοντέλο ποντικού δείχνουν, μειωμένο αριθμό πολλαπλασιασμού των aNSCs σε p75 ko ποντίκια. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν την αναγκαιότητα του p75NTR στην ενήλικη νευρογένεση. Σε ένα δεύτερο βήμα, εξετάσαμε τις επιπτώσεις της διαγραφής στη διαφοροποίηση των NSCs, χρησιμοποιώντας τους δείκτες Dcx και NeuN και αποκτήσαμε αποτελέσματα που υποδηλώνουν ότι οι ανώριμοι νευρώνες δεν μπορούν να διαφοροποιηθούν περαιτέρω σε ώριμους νευρώνες.Επιπλέον, εξετάσαμε ποντίκια με την ειδική διαγραφή του p75 exonII στα κύτταρα που εκφράζουν νεστίνη. Αυτή η σειρά ποντικών μας δίνει μια απάντηση για τον κυτταροειδικό ρόλο του p75 στη νευρογένεση, καθορίζοντας επίσης τα αυτόνομα ή μη, σηματοδοτικά μονοπάτια που ελέγχουν τη μοίρα των βλαστικών κυττάρων. Επιπλέον, διασταυρώσαμε τα p75 ko exonIII ζώα με τα 5xFAD, ένα μοντέλο ποντικού με ΝΑ εξαρτώμενο από το τοξικό αμυλοειδές-β. Σε αυτή τη σειρά ποντικών, προσδιορίζουμε επίσης επίπεδα νευρογένεσης σε σύγκριση με του αγρίου τύπου.Σε μια φαρμακολογική προσέγγιση της έρευνάς μας, μελετήσαμε τις εξαρτώμενες από τον p75 υποδοχέα επιδράσεις σε ανθρώπινα νευρικά βλαστικά κύτταρα (NPCs) που προέρχονται από επαγώμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPSCs), προκειμένου να ελέγξουμε την σημασία των αποτελεσμάτων που είχαμε από τα προαναφερθέντα ζωϊκά μοντέλα σε ανθρώπινα νευρικά κύτταρα. Να σημειωθεί ότι ο ρόλος του p75NTR δεν έχει μελετηθεί στο παρελθόν σε ανθρώπινα NPCs, γεγονός που αναδεικνύει την καινοτομία της εργασίας μας. Η μελέτη της συμμετοχής του p75NTR στην ανθρώπινη νευρογένεση περιέλαβε διάφορα ερευνητικά ερωτήματα. Πρώτον, προσδιορίσαμε την έκφραση και την δραστηριότητα του p75NTR καθώς και των ενδοκυττάριων διαμεσολαβητών του. Επιπλέον, διερευνήσαμε τις επιδράσεις του p75NTR σε NPCs που προέρχονται από ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (hiPSCs), διασαφηνίζοντας τη σηματοδότηση του υποδοχέα και τη δυσλειτουργία του σε NPCs που προέρχονται από ασθενείς με ΝΑ που φέρουν τη μετάλλαξη ApoE4. Επιπλέον, δεικνύουμε τις δράσεις του p75NTR στην επιβίωση των NPCs που προέρχονται από hiPSCs υπό την παρουσία των ολιγομερών αμυλοειδούς Aβ, διερευνώντας τη συμμετοχή του υποδοχέα τόσο στην εξέλιξη της ΝΑ, όσο και στο ρόλο της ανθρώπινης νευρογένεσης στην ΝΑ. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο του p75NTR στη κυτταρική τύχη των NPCs και τον πιθανό θεραπευτικό του ρόλο στον άνθρωπο. Επιπροσθέτως, για να αποκρυπτογραφήσουμε τις σηματοδοτικές ιδιότητες του υποδοχέα, δοκιμάσαμε μια βιβλιοθήκη νέων, συνθετικών αναλόγων της δευδροεπιανδροστερόνης (DHEA), με συγκεκριμένες φαρμακολογικές ιδιότητες που θα μπορούσαν να δράσουν στον p75NTR και να ενεργοποιήσουν επιλεκτικά συγκεκριμένα μονοπάτια σηματοδότησής του. Παρά τις ευεργετικές επιδράσεις των νευροτροφινών στη λειτουργία του εγκεφάλου, η θεραπευτική τους χρήση δεν είναι εφικτή λόγω της πολυπεπτιδικής τους φύσης και της αδιαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Για να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί, οι προηγούμενες μελέτες μας απέδειξαν ότι συνθετικά ανάλογα που προέρχονται από τη DHEA μπορούν να δράσουν όπως οι νευροτροφίνες, καθώς ενεργοποιούν εκλεκτικά τους υποδοχείς νευροτροφινών και μιμούνται τις ενδογενείς νευροτροφίνες, στερούνται ενδοκρινικών παρενεργειών, κι επομένως έχουν προτιμητέα φαρμακολογικά χαρακτηριστικά. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε τιςβιολογικές δράσεις ενός νεοσυντιθέμενου αναλόγου, του ENT-A044, και τον ρόλο του στην επαγωγή κυτταροειδικών λειτουργιών του p75NTR. Η χορήγηση του αναλόγου καλλιέργειες ανθρώπινων NPCs που προέρχονται από iPSCs, έδειξε σημαντική αύξηση στον κυτταρικό θάνατο και αύξησε την έκφραση της pJNK μέσω του p75NTR, σε αντίθεση με πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες που προέρχονται από ποντίκια, όπου το ENT-A044 οδήγησε σε επιβίωση. Έτσι, το ανάλογο νευροτροφίνης ENT-A044 ενεργοποιεί τον υποδοχέα νευροτροφινών p75, ρυθμίζοντας τη νευρωνική επιβίωση με τρόπο εξαρτώμενο από το είδος του κυττάρου και του οργανισμού προέλευσης του. Συμπερασματικά, το ENT-A044 προτείνεται ως μόριο-οδηγός για την ανάπτυξη νέων φαρμακολογικών παραγόντων, παρέχοντας νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις και ερευνητικά εργαλεία, μέσω του ελέγχου σηματοδότησης του p75NTR.Τα αποτελέσματα των μελετών μας προσφέρουν πολύτιμα εργαλεία για τον επιλεκτικό έλεγχο του p75NTR στη ΝΑ, προκειμένου να ελεγχθεί το ενδογενές δυναμικό νευρογένεσης ως ένας νέος μηχανισμός νευρικής επιδιόρθωσης. Επιπλέον, η ενήλικη νευρογένεση είναι ένα νέο επιστημονικό πεδίο με πολλά σημαντικά ευρήματα αλλά κι αντικρουόμενες απόψεις. Η ανακάλυψη του δυναμικού της ενήλικης νευρογένεσης στον εγκέφαλο ανοίγει νέους δρόμους και θεραπευτικές ευκαιρίες για τη αντιμετώπιση νευρολογικών ασθενειών, ιδίως μέσω της εκμετάλλευσης της ενδογενούς αναγεννητικής ικανότητας. Η λεπτομερής χαρτογράφηση των ιδιοτήτων και των λειτουργιών σε επίπεδο ενός κυττάρου, με βάση τη χωρικο-χρονική έκφραση πολυλειτουργικών ρυθμιστικών υποδοχέων, όπως ο p75NTR, θα μπορούσε να αποτελέσει σημαντικό πλεονέκτημα για τον έλεγχο της νευρογένεσης και των σχετικών γνωστικών λειτουργιών