Analyses moléculaires du traitement et de l'apprentissage visuels chez les abeilles mellifères

Abstract

Ici, nous avons développé des études couvrant l'exploration des propriétés de l'opsine et les changements d'expression des gènes dans le cerveau de l'abeille pendant l'apprentissage et la rétention des couleurs afin de combler ce vide. Nous avons caractérisé la distribution de l'opsine dans le système visuel des abeilles, en nous concentrant sur la présence de deux types d'opsines vertes (Lop1 et Lop2). Nous avons confirmé que Lop1 n'est présente que dans les ommatidies de l'œil composé, tandis que Lop2 était confinée aux ocelles. Nous discutons des raisons de cette ségrégation spatiale, puis développons une approche CRISPR/Cas9 pour déterminer les éventuelles différences fonctionnelles entre ces opsines. Nous avons créé avec succès des abeilles mutantes adultes lop1 et lop2 au moyen de la technologie CRISPR/Cas9 et nous avons également développé des mutants du gène blanc comme contrôle de l'efficacité de notre méthode. Nous décrivons la méthodologie CRISPR/Cas9 utilisée dans notre travail et présentons les résultats des tests fonctionnels des mutants générés au moyen d'un protocole de conditionnement dans lequel les abeilles apprennent à inhiber la phototaxie vers la lumière chromatique basée sur la punition par choc électrique (protocole Icarus). Les mutants White et Lop2 ont appris à inhiber la phototaxie spontanée à la lumière bleue mais pas les mutants Lop1. Ces résultats indiquent que les réponses phototactiques à la lumière bleue sont médiées principalement par les photorécepteurs à œil composé contenant Lop1 mais pas par le système ocellaire qui contiennent Lop2. En conséquence, les mutants blancs et Lop2 présentaient une mémoire aversive pour la couleur comparable aux abeilles témoins, mais les mutants Lop1 ne présentaient aucune mémoire. Nous discutons ces résultats en termes de vision chromatique et des conséquences que la mutation induite pourrait avoir sur d'autres mécanismes de signalisation neuronale. Enfin, nous avons analysé l'expression immédiate des gènes précoces (IEG) dans des zones spécifiques du cerveau de l'abeille après l'apprentissage des couleurs dans un environnement de réalité virtuelle (VR). Nous avons soumis les abeilles à une VR 2D dans laquelle seuls les mouvements latéraux des stimuli étaient possibles et à une VR 3D qui procurait une sensation plus immersive. Nous avons analysé les niveaux d'expression relative de trois IEG (kakusei, Hr38 et Egr1) dans les calices des corps de champignons, les lobes optiques et le reste du cerveau après l'apprentissage de la discrimination des couleurs. Dans la réalité virtuelle 3D, les apprenants qui ont réussi ont présenté une régulation positive d'Egr1 uniquement dans les calices des corps de champignons, révélant ainsi une implication privilégiée de ces régions cérébrales dans l'apprentissage associatif des couleurs. Pourtant, dans le 2D VR; Egr1 était régulé à la baisse dans les OL, tandis que Hr38 et kakusei étaient régulés à la baisse dans les calices des MB. Bien que les deux scénarios VR pointent vers des activations spécifiques des calices des corps de champignons (et des circuits visuels dans la VR 2D), la différence détectée suggère que les différentes contraintes des deux VR peuvent conduire à différents types de phénomènes neuronaux. Alors que les scénarios VR 3D permettant la navigation et l'apprentissage exploratoire peuvent conduire à une régulation positive de l'IEG, les scénarios VR 2D dans lesquels les mouvements sont limités induisent des niveaux plus élevés d'activité inhibitrice dans le cerveau de l'abeille. Dans l'ensemble, nous proposons une série de nouvelles explorations du système visuel, y compris de nouvelles analyses fonctionnelles et le développement de nouvelles méthodes pour étudier la fonction de l'opsine, qui font progresser notre compréhension de la vision et de l'apprentissage visuel des abeilles.Honey bees are endowed with the capacity of color vision as they possess three types of photoreceptors in their retina that are maximally sensitive in the ultraviolet, blue and green domains owing to the presence of corresponding opsin types. While the behavioral aspects of color vision have been intensively explored based on the easiness by which free-flying bee foragers are trained to color stimuli paired with sucrose solution, the molecular underpinnings of this capacity have been barely explored. Here we developed studies that spanned the exploration of opsin properties and changes of gene expression in the bee brain during color learning and retention in controlled laboratory protocols to fill this void. We characterized opsin distribution in the honey bee visual system, focusing on the presence of two types of green opsins (Amlop1 and Amlop2), one of which (Amlop2) was discovered upon sequencing of the bee genome. We confirmed that Amlop1 is present in ommatidia of the compound eye but not in the ocelli, while Amlop2 is confined to the ocelli. We developed a CRISPR/Cas9 approach to determine possible functional differences between these opsins. We successfully created Amlop1 and Amlop2 adult mutant bees by means of the CRISPR/Cas9 technology and we also produced white-gene mutants as a control for the efficiency of our method. We tested our mutants using a conditioning protocol in which bees learn to inhibit attraction to chromatic light based on electric-shock punishment (Icarus protocol). White and Amlop2 mutants learned to inhibit spontaneous attraction to blue light while Amlop1 mutants failed to do so. These results indicate that responses to blue light, which is also partially sensed by green receptors, are mediated mainly by compound-eye photoreceptors containing Amlop1 but not by the ocellar system in which photoreceptors contain Amlop2. Accordingly, 24 hours later, white and Amlop2 mutants exhibited an aversive memory for the punished color that was comparable to control bees but Amlop1 mutants exhibited no memory. We discuss these findings based on controls with eyes or ocelli covered by black paint and interpret our results by discussing use of chromatic vs. achromatic vision via the compound eyes and the ocelli, respectively. Finally, we analyzed immediate early gene (IEG) expression in specific areas of the bee brain following color vision learning in a virtual reality (VR) environment. We changed the degrees of freedom of this environment and subjected bees to a 2D VR in which only lateral movements of the stimuli were possible and to a 3D VR which provided a more immersive sensation. We analyzed levels of relative expression of three IEGs (kakusei, Hr38, and Egr1) in the calyces of the mushroom bodies, the optic lobes and the rest of the brain after color discrimination learning. In the 3D VR, successful learners exhibited Egr1 upregulation only in the calyces of the mushroom bodies, thus uncovering a privileged involvement of these brain regions in associative color learning. Yet, in the 2D VR, Egr1 was downregulated in the OLs while Hr38 and kakusei were coincidently downregulated in the calyces of the MBs in the learned group. Although both VR scenarios point towards specific activations of the calyces of the mushroom bodies (and of the visual circuits in the 2D VR), the difference in the type of expression detected suggests that the different constraints of the two VRs may lead to different kinds of neural phenomena. While 3D VR scenarios allowing for navigation and exploratory learning may lead to IEG upregulation, 2D VR scenarios in which movements are constrained may induce higher levels of inhibitory activity in the bee brain. Overall, we provide a series of new explorations of the visual system, including new functional analyses and the development of novel methods to study opsin function, which advances our understanding of honey bee vision and visual learning