Étude des mécanismes de signalisation moléculaire contrôlés par le récepteur NOD FACTOR PERCEPTION chez Medicago truncatula

Abstract

État de l'art: En contribuant grandement à la fixation biologique de l'azote atmosphérique, la symbiose rhizobium- légumineuse joue un rôle clé dans l'agriculture durable en réduisant l'utilisation d'engrais azotés coûteux et polluants. Cette symbiose a une grande spécificité d'hôte. Ainsi, les facteurs de nodulation (NF), synthétisés via les gènes nod, sont les déterminants clés du choix du partenaire bactérien. Chez la plupart des légumineuses, la perception des NF requiert des récepteurs kinases à motif lysin (LysM-RLK). Lors de l'interaction entre Medicago truncatula spp. Jemalong A17 et Sinorhizobium meliloti, NOD FACTOR PERCEPTION (NFP) est essentiel pour les réponses précoces au NF et à la nodulation. NFP joue également un rôle dans l'immunité des plantes. Ainsi, NFP pourrait être impliqué dans différents complexes de récepteurs membranaires nécessaires à la perception de différents signaux et conduisant soit à l'immunité, soit à la symbiose. Méthodologie: A l'aide d'une approche multidisciplinaire combinant des analyses moléculaires, génétiques, biochimiques, cellulaires et physiologiques, deux interacteurs présomptifs de NFP, LYK2bis et SUPPRESSION OF BIR1 (SOBIR1) ont été caractérisés. Le travail de thèse a consisté à valider leur interaction physique avec NFP. Les propriétés biochimiques de ces kinases ont été analysées in vitro et leurs rôles symbiotiques ont été étudiés in planta à l'aide d'expériences de génétique inverse. Résultats: (i) Contrairement à A17, l'écotype M. truncatula spp. tricycla R108 est capable d'être nodulé par le mutant nodF/nodL de S. meliloti, produisant des NF modifiés. Le déterminant génétique sous-jacent à l'extension de la spécificité de nodulation a été identifié comme étant LYK2bis, un LysM-RLK nouvellement apparu chez R108. L'expression de LYK2bis chez A17 lui permet d'acquérir la capacité à être nodulé par nodF/nodL. LYK2bis co- localise et interagit physiquement avec NFP in planta. Son domaine kinase (KD) est fonctionnel et trans- phosphoryle in vitro le domaine pseudo kinase de NFP (NFP-KD). LYK2bis est également requis pour la nodulation de l'écotype R108 avec certaines souches naturelles de rhizobium. (ii) SOBIR1 est un récepteur kinase à répétition riche en leucine (LRR-RLK) décrit comme un régulateur positif de l'immunité chez les végétaux. SOBIR1 interagit physiquement avec NFP dans la membrane plasmique in planta. Son KD est actif et trans-phosphoryle NFP-KD in vitro. L'analyse des mutants sobir1 et sobir1/nad1 indique que ce gène n'est ni essentiel à la nodulation ni impliqué dans l'activation de l'immunité dans les nodosités. Conclusion: Dans cette thèse, 2 partenaires de NFP ont été fonctionnellement caractérisés. LYK2bis, un LysM-RLK apparu récemment, étend la spécificité de nodulation de l'écotype R108 aux souches de S. meliloti produisant des NF modifiés. De plus, LYK2bis est important pour la nodulation avec de nombreuses rhizobia naturelles. Ainsi, ce gène présenterait un avantage adaptatif permettant la nodulation avec une plus grande diversité de rhizobia. SOBIR1 est un LRR-RLK localisé sur la membrane plamique. Bien qu'aucun rôle symbiotique clair n'ait été identifié, il semblerait qu'un complexe SOBIR1 - NFP in planta puisse participer à la signalisation immunitaire. Ainsi, ces résultats ont fourni des informations sur une plateforme de signalisation centrée sur NFP, pouvant impliquer différents co-récepteurs nécessaires à la perception de divers signaux permettant aux plantes d'établir une symbiose ou d'activer des réponses de défense.Background: The legume-rhizobia symbiosis, which is a major contributor of biological nitrogen fixation, plays an important role in sustainable agriculture by reducing the use of costly and polluting nitrogen fertilizers. This symbiotic interaction is usually specific between a certain rhizobium strain with a limited range of host plants. Rhizobial nodulation factors (NFs), specified by nod genes, are the key determinants that primarily define partner specificity. The perception of NFs in most studied legumes requires lysin motif receptor-like kinases (LysM-RLKs). In the interaction between Medicago truncatula cv. Jemalong A17 and Sinorhizobium meliloti, the LysM-RLK NOD FACTOR PERCEPTION (NFP) is essential for both early NF responses and nodulation while LysM-RLK 3 (LYK3) is important for bacterial infection. In addition, NFP also plays a role in plant immunity. It is hypothesised that NFP is involved in different receptor complexes required for the perception of different signals leading to either symbiosis or immunity. Methodology: In this project, two putative NFP interactor candidates, LYK2bis and SUPPRESSION OF BIR1 (SOBIR1), have been functionally characterised and examined for their involvement in symbiosis using a combination of molecular, genetic, biochemical, cellular, and physiological analyses. The work involved studying the physical interaction between NFP and the two candidate proteins using a fluorescence-based technology. The biochemical properties of both proteins were analysed using in vitro kinase assays. Their physiological roles in symbiosis were characterised using reverse genetics. Results: (i) The nodF/nodL S. meliloti mutant, which produces modified NFs, was discovered to be able to nodulate the genotype M. truncatula spp. tricycla R108 but not A17. The genetic determinant underlying the nodulation specificity extension was identified as LYK2bis which is a newly-evolved LysM-RLK in R108, that is a chimera between LYK2 and LYK3. Expressing LYK2bis in A17 allows the plant to gain the ability to be nodulated by the mutant strain. LYK2bis colocalises and physically interacts with NFP in planta and its kinase domain (KD) is active and can trans-phosphorylate the NFP pseudo-KD. LYK2bis is also required for nodulation of R108 with some but not all natural rhizobial strains tested. (ii) SOBIR1 is a leucine-rich repeat (LRR) RLK, that is well-known as a positive regulator of immunity in other plants. SOBIR1 colocalises and physically interacts with NFP in planta. Its KD possesses an autophosphorylation activity and can trans-phosphorylate NFP-KD. The phosphosites in NFP-KD were identified and functionally studied. Analyses of sobir1 and its double mutant with a nodule defence suppressor gene indicated that it is not essential for nodulation and is not required for the activation of defence in nodules. Conclusion: In this project, two NFP interactors belonging to two different RLK subfamilies have been functionally characterised. LYK2bis is a newly-evolved LysM-RLK in R108 that extends nodulation specificity of this genotype to certain S. meliloti mutants and is important for nodulation by many natural Sinorhizobia. Evolution of this gene may present an adaptive advantage to allow nodulation by a greater variety of strains. SOBIR1 is a membrane- localised LRR-RLK, which physically interacts with NFP and can trans-phosphorylate NFP-KD. Although no clear symbiotic role has been found for SOBIR1, it is possible that a receptor complex between SOBIR1 and NFP in planta can mediate other plant responses as NFP is also involved in immune signalling. In summary, the results from this project have provided insights into a receptor hub centred by NFP which may involve different co-receptors, required for the perception of various signals that allow plants to either establish symbiosis or immunity