Targeting the adipose tissue to treat fatty liver: role of TGR5

Abstract

Tese de mestrado, Ciências Farmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma condição cuja prevalência está a crescer globalmente e está a caminho de se tornar a principal causa de doença hepática crónica. De facto, é possível que se torne, também, uma das principais causas de transplantes hepáticos. Atualmente, estima-se que uma em cada quatro pessoas no mundo sofra de FGNA. Em termos da sua progressão, o FGNA está inicialmente associado à acumulação de gordura no fígado (esteatose), mas pode evoluir para características histológicas menos favoráveis, nomeadamente esteatohepatite não-alcoólica (EHNA), despoletada pela inflamação e associada ao desenvolvimento de fibrose. Numa fase mais avançada, pode também levar a um estadio de cirrose e, eventualmente, ao aparecimento de carcinoma hepatocelular. Além disso, a patogénese desta doença está intimamente ligada à resistência à insulina e à desregulação do normal funcionamento do tecido adiposo. Infelizmente, ainda não existem medidas terapêuticas eficazes que estejam aprovadas para o tratamento do FGNA. Desde modo, torna-se de extrema importância a descoberta e o estudo de opções de tratamento para esta patologia, já que também a prevalência da diabetes tipo 2 e da obesidade deverão aumentar nos próximos anos. Num estado de obesidade, a libertação de ácidos gordos e citoquinas pelo tecido adiposo branco encontra-se aumentada, principalmente quando a acumulação de gordura é potenciada no tecido adiposo visceral e quando a capacidade de “absorção” de ácidos gordos nos tecidos subcutâneos se esgota. Assim sendo, os ácidos gordos não acumulados no tecido adiposo podem causar danos no fígado, ao serem transportados pela veia porta até este órgão. No entanto, os adipócitos castanhos e bege, cuja formação tem lugar no tecido adiposo branco através de um processo denominado “browning”, estão a revolucionar a forma como o tecido adiposo é percecionado, uma vez que estas células tem a capacidade de transformar energia em calor, promovida pela proteína uncoupling protein 1 (UCP1), em vez de acumular gordura. Atualmente, existem vários estudos centrados na descoberta de fatores que consigam potenciar atividade dos adipócitos castanhos e a formação dos adipócitos beges; e também focados em perceber quais os mecanismos envolvidos. Neste contexto, foi demonstrado que os ácidos biliares parecem potenciar o funcionamento dos adipócitos castanhos e também o processo do “browning”, através da estimulação de recetores celulares, em particular o recetor Takeda G-protein coupled bile acid receptor (TGR5). O TGR5 é expresso em diferentes tipos celulares (p. e. adipócitos, macrófagos e enterócitos) mas pouco expresso em hepatócitos. A sua atividade pode ser promovida por ácidos biliares, com diferentes graus de atividade, mas também já surgiram agonistas sintetizados em laboratório. Para além de induzir o “browning”, a atividade do TGR5 também é reconhecida por melhorar a obesidade, diminuir a resistência à insulina, a esteatose e as respostas inflamatórias. Assim sendo, a atividade do TGR5 tem sido estudada como uma possível abordagem terapêutica para doenças metabólicas. Estudos recentes realçam o papel que as vesículas extracelulares (EVs) libertadas do tecido adiposo parecem exercer na perpetuação da obesidade, resistência à insulina e até no FGNA, ao serem internalizados pelos hepatócitos onde o seu conteúdo - lípidos, proteínas e microRNAs, entre outros, é libertado. De notar que, a origem e contexto em que surgem estas EVs podem ditar os seus efeitos funcionais noutros órgãos. Por exemplo, EVs com origem no tecido adiposo visceral poderão ser mais facilmente associadas a um efeito metabólico negativo quando introduzidas noutras células ou órgãos. Neste estudo, o objetivo global foi avaliar o papel funcional de EVs libertadas por adipócitos, na presença ou ausência de ativadores do TGR5, sobre células hepáticas num contexto de inflamação. Adipócitos 3T3-L1 diferenciados foram expostos a diferentes agonistas do TGR5, incluindo ácidos biliares. A ativação do TGR5 foi comprovada pelo aumento dos níveis de expressão da proteína de UCP1, bem como do próprio TGR5. Culturas enriquecidas em adipócitos diferenciados, usando a técnica Density-based separation followed by Replating of Enriched Adipocytes in Monolayer (DREAM), exibiram ativação de TGR5 ligeiramente aumentada. Em seguida, o meio de cultura das células onde se observou maiores níveis de ativação do TGR5 foram processados para isolamento de EVs. Em paralelo, hepatócitos humanos HepG2 foram tratados com LPS para induzir inflamação, confirmada pelo aumento da expressão de mediadores pro-inflamatórios, nomeadamente IL-8, IL-1β, TNF-α e CCL2. Por fim, a incubação de células HepG2 com EVs de adipócitos onde o TGR5 tinha sido ativado, uma hora antes da adição de LPS às culturas celulares, reduziu consideravelmente o aumento de citocinas inflamatórias em resposta a este estímulo inflamatório. O segundo objetivo foi usar ratinhos com deleção do TGR5 no tecido adiposo, alimentados com uma dieta indutora de FGNA, para avaliar em detalhe o papel da expressão e ativação do TGR5 no tecido adiposo, in vivo. Devido aos atrasos na obtenção dos ratinhos transgénicos a partir dos nossos colaboradores, assim como todas as outras restrições impostas pela pandemia da COVID-19, o modelo ainda não está concluído. No entanto, relatamos já as experiências de otimização inicial que foram realizadas, em particular a otimização da atividade Cre induzida por tamoxifeno e genotipagem. No geral, os nossos resultados sugerem que EVs de adipócitos com o TGR5 ativado contêm moléculas capazes de exercer uma função anti-inflamatória em hepatócitos. Resultados sobre o papel do TGR5 no tecido adiposo durante os diferentes estadios de FGNA, in vivo, serão críticos para estabelecer inequivocamente se a ativação do TGR5 no tecido adiposo comunica efeitos metabólicos ao fígado por meio da modulação do conteúdo de EVs. Uma vez que resultados recentes sugerem que os adipócitos podem regular o metabolismo por meio da libertação de exosomas contendo miRNAs, e uma vez que agonistas do TGR5 estão a ser avaliados em ensaios clínicos para o FGNA, os nossos resultados atuais e futuros poderão ter importantes implicações terapêuticas e elucidar circuitos de sinalização que integram alvos tangíveis para a prevenção, gestão e/ou tratamento da obesidade e FGNA.Com o patrocínio do iMed.ULisboa, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa