Kasvatusolosuhteiden vaikutus kaksoisjuoste-RNA-virusten esiintymiseen juurikäävässä

Abstract

The aim of this final year project was to research the possibility of increasing the concentration of Heterobasidion sp. viruses in the fresh cultures of fungal mass. The fungal mass of Heterobasidion sp. is grown for the studies of the Heterobasidion sp. viruses. Increased virus concentration in the sample would confirm the interpretation and reliability of the research results in future. Different kinds of complex mediums and one synthetic medium were prepared to study the influence to growing of fungal mass and concentration of viruses. The mediums were synthetic Hagem-agar, MOS (modified orange serum) –agar with spruce needle-extract, MOS-agar with spruce sawdust and V8-agar with vegetable juice. The growth temperature used in addition in MOS-agar was 28 °C instead of the commonly used 22 °C. To screen the content of Heterobasidion sp. viruses, virus RNA molecules were separated from fungal mass and from other nucleic acids by using specific binding of double-stranded RNA to CF-11-cellulose powder. The CF-11-isolation method is based on the cellulose powder’s affinity for nucleic acids and the adsorption of double-stranded RNA at ethanol concentrations of 15 %. Isolation of the double-stranded RNA includes the breaking of cells chemically and by homogenizator, cleaning with phenol-chloroform extractions and washing in columns with buffers. In the end there was a gel electrophoresis. It is possible to speed and raise the growth of Heterobasidion sp. fungal mass and increase the concentration of Heterobasidion sp. viruses by using a proper medium. It was shown that improper medium or conditions will weaken the growth of fungal mass and reduce the amount of viruses. The best result with virus concentration and with the growth of Heterobasidion sp. fungal mass was given by MOS-agar with spruce sawdust. This agar can be used as a medium for Heterobasidion sp. species with low virus concentration. As a result of this final year project, also new mediums will be tested to gain even higher virus concentration in the Heterobasidion sp. fungal mass.Insinöörityön tarkoituksena oli selvittää, voidaanko juurikääpävirusten puhdasviljelmissä esiintyvien virusten pitoisuutta lisätä. Juurikääpärihmaston puhdasviljelmiä kasvatetaan juurikääpävirusten määritykseen liittyviin tutkimuksiin. Lisääntynyt viruspitoisuus tutkittavassa näytteessä vahvistaisi tutkimustulosten tulkittavuutta ja luotettavuutta, helpottaisi virusten määritystyötä jatkotutkimuksissa ja vähentäisi työstä aiheutuvia kustannuksia. Työssä valmistettiin erilaisia kompleksisia kasvualustoja ja yksi synteettinen kasvualusta, joiden vaikutusta juurikääpärihmaston kasvuun ja viruspitoisuuden muutoksiin tutkittiin. Kasvualustat olivat synteettinen Hagem-agar, kuusenneulasuutetta sisältävä MOS (modified orange serum) -agar, kuusen purua sisältävä MOS-agar ja V8-agar, joka sisältää vihannesmehua. Lisäksi MOS-agarilla kasvatettiin 28 °C:ssa yleensä kasvatuslämpötilana käytetyn 22 °C:n sijaan. Viruksen pitoisuuden toteamiseksi virusperäiset RNA-molekyylit puhdistettiin sienirihmastosta ja muista nukleiinihapoista käyttämällä hyväksi kaksoisjuoste-RNA:n spesifistä sitoutumista CF-11-selluloosakuituun. Menetelmä perustuu selluloosakuidun nukleiinihappojen affiniteettiin ja 15-prosenttisessa etanolikonsentraatiossa tapahtuvaan kaksoisjuoste-RNA:n adsorptioon. Kaksoisjuoste-RNA-eristysmenetelmään sisältyi mm. solujen rikkominen kemiallisesti ja homogenisaattorilla, puhdistus fenoli- ja kloroformiuutoilla, näytteiden pesu kolonnien läpi pesupuskureilla sekä lopuksi geelielektroforeesiajo. Työn tuloksista ilmeni, että juurikäävän rihmaston kasvua voidaan nopeuttaa ja lisätä käyttämällä sopivaa kasvualustaa sekä lisätä juurikäävän viruspitoisuutta juurikääpärihmastossa. Epäsopiva kasvualusta tai olosuhteet taas heikentävät rihmaston kasvua ja vähentävät viruspitoisuutta. Kasvualustoista parhaimman tuloksen viruspitoisuuden ja juurikääpärihmaston kasvun kannalta antoi kuusenpuru-MOS-agar. Tätä agaria voidaan käyttää jatkotutkimuksissa pienen viruspitoisuuden omaaville juurikääpäkannoille. Tämän työn tulosten valossa myös uusia kasvualustoja tullaan kokeilemaan virussaannon lisäämiseksi juurikääpärihmastossa